專利名稱：一種重組人粒細(xì)胞集落刺激生長因子用微生物篩選而制備的方法，其藥物組合物及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體講，涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激生長因子用微生物篩選而制備的方法，其藥物組合物及制劑。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是一種糖蛋白，含有174個氨基酸，分子量約為20000。主要由內(nèi)毒素、TNF-α和IFN-Y可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。G-CSF基因全長2.5kb，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，G-CSF有5個半胱氨酸，Cys36與Cys42，Cys74與Cys64之間形成兩對二硫鍵，Cysl7為不配對半胱氨酸，二硫鍵對于維持G-CSF生物學(xué)功能是必須的因素。人和小鼠G-CSF在氨基酸水平上有73%同源性，并具有相互交叉的生物學(xué)活性。G-CSF主要作用于中性粒細(xì)胞系(lineage)造血細(xì)胞的增殖、分化和活化。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、單核巨噬細(xì)胞成熟，促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放，并能促進(jìn)巨噬細(xì)胞及噬酸性細(xì)胞的多種功能。臨床主要用于預(yù)防和治療腫瘤放療或化療后引起的白細(xì)胞減少癥、治療骨髓 造血機能障礙及骨髓增生異常綜合征、預(yù)防白細(xì)胞減少可能潛在的感染并發(fā)癥、以及使感染引起的中性粒細(xì)胞減少的恢復(fù)加快。人粒細(xì)胞集落刺激生長因子是一種造血生長因子，它在刺激增殖、分化和活化血細(xì)胞的功能等方面具有重要的作用；其分子在17位包含一個自由半胱氨酸，并含有兩對二硫鍵，即Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，這兩對二硫鍵對于其活性是必須的；然而，hG_CSF的來源是非常有限的，因此在工業(yè)中，必須用基因工程的方法來生產(chǎn)它。通常在E.coli中表達(dá)重組hG-CSF(rhG-CSF)，它以不溶于水的包涵體的形式存在，因此必須用高濃度的變性劑溶解，這樣溶解得到的蛋白是以去折疊狀態(tài)存在的，必須對其進(jìn)行復(fù)性，然后采用多步色譜步驟對其進(jìn)行純化，但其質(zhì)量回收率不到20%。為此，本發(fā)明提出了一種回收率高、生物活性高的重組人粒細(xì)胞集落刺激生長因子的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出了一種重組人粒細(xì)胞集落刺激生長因子用微生物篩選而制備的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為:—種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述的制備方法的步驟為:(I)將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)對發(fā)酵培養(yǎng)基所得菌體進(jìn)行超聲破碎，收集包涵體，用包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌后低溫離心；
(3)包涵體中加入包涵體溶解液，4°C條件下8 12小時后,離心得到包涵體提取液；(4)在2 8°C條件下,采用SephacrylS-200凝膠柱對提取液進(jìn)行分離,收集復(fù)性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子餾分；(5)再采用S印hadexG25柱進(jìn)行分離，得到人重組人細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(2)中，將收集的菌體用TE緩沖液洗滌I 3次，然后采用超聲破碎0.5 I小時，低溫離心，收集包涵體；再加入包涵體洗滌液，O 4°C條件下混合20 60分鐘，低溫離心。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(2)中，所述的TE緩沖液為:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵體洗滌液為:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/LEDTA+2mmol/L脲+0.5%Tritonx-100, pH8.0 ;包涵體重量與包涵體洗滌液的體積比為1:10 20，優(yōu)選 I =IO0本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(3)中，所述的包涵體溶解液為:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA+7mmol/L 鹽酸胍+20mmol/L DTT, ρΗ8.0 ;包涵體質(zhì)量與包涵體溶解液的體積之比為:1:5 10，優(yōu)選1:10。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(4)中，所述的色譜條件為:流動相為:0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG, pH7.8 ；流速為2mL/min ；檢驗波長為280nm。
本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(4)中，所述的SuperdeX75凝膠柱先用流動相平衡，然后進(jìn)樣對包涵體提取液進(jìn)行分離。本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(5)中，將收集的復(fù)性的人重組粒細(xì)胞集落刺激因子餾分用10%的冰醋酸調(diào)節(jié)至pH為4.0 4.5，優(yōu)選pH為4.2 ;低溫離心20 40分鐘得上清液，上清液上SephadeXG25柱，用洗脫液洗脫，收集主峰進(jìn)行分離，得到人重組人細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明的第七優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(5)中，所述的S印hadexG25柱先采用pH為4.0 4.5的20mmol/L的醋酸鈉平衡，優(yōu)選為pH為4.2。本發(fā)明的第八優(yōu)選技術(shù)方案為:在步驟(5)中，所述的洗脫液為:10mmol/L的氯化鈉+15mmol/L的醋酸鈉，pH為4.4。本發(fā)明還涉及一種由本發(fā)明的制備方法制備得到的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物，所述的藥物組合物的組成為:重組人粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 100重量份。所述的藥物組合物的劑型為凍干粉針或水針；其中，當(dāng)所述的劑型為水針時，藥物組合物的組成為重組人粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 10重量份；當(dāng)所述的劑型為凍干粉針時，藥物組合物的組成為重組人粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇50 100重量份。下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明。本發(fā)明的采用凝膠色譜柱對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行處理，通過對色譜條件的精細(xì)控制，使通過步驟4得到的hG-GSF的質(zhì)量回收率達(dá)到48.9%，比活為4.4X 108IU/mg，純度為89.6%。經(jīng)過步驟5進(jìn)行進(jìn)一步的純化，其純度可達(dá)99.75%，步驟5的回收率為96.3%, hG-GSF的比活為4.3X 108IU/mg。本發(fā)明的制備方法其總質(zhì)量回收率可達(dá)46.8%,純度達(dá)到99.75%,比活為4.3X 108IU/mg。本發(fā)明還涉及重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物，并且該藥物組合物可制備成多種劑型。在該藥物組合物中，可以添加適量的賦形劑、穩(wěn)定劑等添加劑。本發(fā)明中選用了效果較好的甘露醇。其中藥物輔料的選擇以及制備方法可選用常規(guī)方法制備。規(guī)格可按照市場的需要，制備成50 μ g/支、100 μ g/支、150 μ g/支、300 μ g/支等不同的規(guī)格。本發(fā)明的制備方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中重組人粒細(xì)胞集落刺激因子生物發(fā)酵方法制備過程中產(chǎn)率低的技術(shù)難題，并且適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的具體實施方式
僅限于進(jìn)一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實施例方式實施例1制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子:1.選用工程菌DH5 a _PBV220_hGCSF菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；2.將收集的菌體用TE緩沖液洗滌3次，然后采用超聲破碎0.5 I小時，低溫離心，收集包涵體；再加入包涵體洗滌液，4°C條件下混合30分鐘，4°C低溫離心；TE緩沖液為:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵體洗漆液為:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L脲+0.5%Tritonx-100, pH8.0 ;包涵體重量與包涵體洗滌液的體積比為1:10 ；

3.包涵體中加入包涵體溶解液，4°C條件下12小時后,離心得到包涵體提取液；所述的包涵體溶解液為:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+7mmol/L鹽酸胍+20mmol/L DTT,ρΗ8.0 ;包涵體質(zhì)量與包涵體溶解液的體積之比為1:10 ;4.采用SephacrylS-200凝膠柱,在4°C條件下,先用流動相平衡，提取液上柱色譜條件為:流動相為:0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG, pH8.0 ；流速為2mL/min ；檢驗波長為280nm ；收集復(fù)性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子餾分；5.將收集的復(fù)性的人重組粒細(xì)胞集落刺激因子餾分用10%的冰醋酸調(diào)節(jié)至pH為
4.2，低溫離心30分鐘得上清液；S^)hadeXG25柱先采用pH為4.2的20mmol/L的醋酸鈉平衡；上清液上S印hadexG25柱，用洗脫液洗脫，洗脫液為:10mmol/L的氯化鈉+15mmol/L的醋酸鈉，pH為4.4 ;收集主峰進(jìn)行分離，得到重組人細(xì)胞集落刺激因子。經(jīng)檢測，所制備得到的重組人細(xì)胞集落刺激因子的質(zhì)量回收率46.8%，純度(HPLC)為99.76%，比活為4.3 X 108IU/mg。制備得到的重組人細(xì)胞集落刺激因子經(jīng)SDS-PAGE在18.8kDa處顯示條帶。6.將得到的重組人細(xì)胞集落刺激因子，用注射用水稀釋，按照100重量份重組人細(xì)胞集落刺激因子添加甘露醇5重量份的比例，經(jīng)0.22 μ m微孔濾器進(jìn)行除菌過濾后，制備成100 μ g/支的水針。或者制備成50 μ g/支、150 μ g/支、300 μ g/支等不同的規(guī)格。實驗例1:S印hacrylS-200凝膠柱洗脫液中脲濃度對hG_GSF的影響改變實施例1中洗脫液中脲的濃度(其他條件和步驟均與實施例1相同)，研究其對重組人細(xì)胞集落刺激因子收率和比活的影響，其結(jié)果如表I所示:表1:
權(quán)利要求
1.一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，所述的制備方法的步驟為: (1)選用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； (2)對發(fā)酵培養(yǎng)基所得菌體進(jìn)行超聲破碎，收集包涵體，用包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌后低溫尚心； (3)包涵體中加入包涵體溶解液，4°C條件下8 12小時后,離心得到包涵體提取液； (4)在2 8°C條件下,采用SephacrylS-200凝膠柱對提取液進(jìn)行分離,收集復(fù)性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子餾分； (5)再采用SephadexG25柱進(jìn)行分離，得到人重組人細(xì)胞集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，將收集的菌體用TE緩沖液洗滌I 3次，然后采用超聲破碎0.5 I小時，低溫離心,收集包涵體；再加入包涵體洗滌液，O 4°C條件下混合20 60分鐘，低溫離心。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的TE緩沖液為:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA, ρΗ8.0 ;包涵體洗滌液為:20mmol/LTris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲 +0.5%Tritonx-100, ρΗ8.0 ;包涵體重量與包涵體洗滌液的體積比為1:10 20，優(yōu)選1:10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述的包涵體溶解液為:20mmol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+7mmol/L鹽酸胍+20mmol/L DTT, ρΗ8.0 ;包涵體質(zhì)量與包涵體溶解液的體積之比為:1:5 10，優(yōu)選1:10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述的色譜條件為: 流動相為:0.15mol/L NaCl+0.05mol/L Tris-HCl+lmmol/L EDTA+2mmol/L 脲+0.8mmol/LGSH+0.2mmol/L GSSG, pH7.8 ； 流速為2mL/min ； 檢驗波長為280nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述的SephacrylS-200凝膠柱先用流動相平衡，然后進(jìn)樣對包涵體提取液進(jìn)行分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(5)中，將收集的復(fù)性的人重組粒細(xì)胞集落刺激因子餾分用10%的冰醋酸調(diào)節(jié)至pH為4.0 4.5，優(yōu)選pH為4.2 ;低溫離心20 40分鐘得上清液，上清液上SephadexG25柱，用洗脫液洗脫，收集主峰進(jìn)行分離，得到人重組人細(xì)胞集落刺激因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述的S印hadexG25柱先采用pH為4.0 4.5的20mmol/L的醋酸鈉平衡，優(yōu)選為pH為4.2 ;所述的洗脫液為:10mmol/L的氯化鈉+15mmol/L的醋酸鈉，pH為4.4。
9.一種由權(quán)利要求1所述的制備方法制備得到的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物的組成為:重組人粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 100重量份。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物的劑型為凍干粉針或水針；其中，當(dāng)所述的劑型為水針時，藥物組合物的組成為重組人粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇5 10重量份；當(dāng)所述的劑型為凍干粉針時,藥物組合物的組成為重組人 粒細(xì)胞集落刺激因子100重量份，甘露醇50 100重量份。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體講，涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激生長因子用微生物篩選而制備的方法。所述的制備方法的步驟為選用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；對發(fā)酵培養(yǎng)基所得菌體進(jìn)行超聲破碎，收集包涵體，用包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌后低溫離心；包涵體中加入包涵體溶解液，4℃條件下8～12小時后，離心得到包涵體提取液；采用SephacrylS-200凝膠柱對提取液進(jìn)行分離，收集復(fù)性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子餾分；再采用SephadexG25柱進(jìn)行分離，得到人重組人細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明還涉及該重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的藥物組合物及制劑。
文檔編號A61K38/19GK103114115SQ201310027678
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者羅誠 申請人:羅誠