專利名稱：：小白菊內(nèi)酯衍生物的合成方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于化學藥合成領域，具體涉及由小白菊內(nèi)酯合成氮代小白菊內(nèi)酯衍生物，經(jīng)化學修飾后的小白菊內(nèi)酯極性增加，更適宜制成注射用制劑。技術背景小白菊內(nèi)酯為一倍半萜內(nèi)酯類化合物，分子中含有一a-亞甲基-Y-內(nèi)酯基團。對小白菊內(nèi)酯的研究頗多，歐美用小白菊治療偏頭疼和關節(jié)疼痛，其主要成分為小白菊內(nèi)酯，近年來對小白菊內(nèi)酯的研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯還具有抗腫瘤活性，如可抑制結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病癌細胞的生長。小白菊內(nèi)酯為一類低極性成分，具有很強的脂溶性，在水中溶解度很小，這大大的限制了小白菊在制藥上的廣泛應用。近年來也有研究修飾小白菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)以增強其水溶性。美國專利US2005272716A1公開了一種修飾小白菊內(nèi)酯的方法。在修飾結(jié)構(gòu)中所使用的催化劑為三乙胺，但三乙胺為一類極危險的溶劑，一級易燃液體，在空氣中的爆炸極限為1.2%8.0%，溶劑有毒，蒸氣或液體能刺激皮膚和粘膜，吸入蒸氣后能使呼吸器官、血液循環(huán)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟及其它粘膜組織等機體失常，生產(chǎn)現(xiàn)場最高容許濃度為25ppm，大大的限制了在工業(yè)上的應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的小白菊內(nèi)酯修飾路線。本發(fā)明中在用含氮化合物修飾小白菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)過程中，采用的是乙醇鈉為催化劑，乙醇鈉無毒，安全性高，能適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明在用乙醇鈉作為催化劑來修飾小白菊內(nèi)酯結(jié)構(gòu)時，對最終產(chǎn)品的得率與美國專利US2005272716A1做了對比，發(fā)現(xiàn)其最終產(chǎn)品得率也在85%以上，和對比文獻所公開的得率相當，但卻解決了工業(yè)實用性的問題，而且反應條件只需在室溫攪拌下即可進行，操作簡便，對合成儀器、場地設施要求不高，普通條件下即可進行，這大大降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明中所用的原料為從廣玉蘭葉中提取分離得到的小白菊內(nèi)酯，提取方法在中國專利申請200710099763.6中已經(jīng)公開。本發(fā)明中所用的原料還有選自二甲基氨、哌啶或吡啶中的任一種。本發(fā)明中所用的催化劑為乙醇鈉。本發(fā)明中經(jīng)修飾得到的小白菊內(nèi)酯衍生物為其氮代衍生物，結(jié)構(gòu)式如下氮代小白菊內(nèi)酯衍生物結(jié)構(gòu)其中R(N源供體)可以為二甲基氨基、二乙基氨基、哌啶基、吡啶基中的任-種，優(yōu)選二甲基氨基、哌啶基、吡啶基，更優(yōu)選哌啶基。本發(fā)明N源供體摩爾數(shù)的量至少為小白菊內(nèi)酯的兩倍，優(yōu)選46倍。實現(xiàn)本發(fā)明的工藝為H圃R2+NaC2H5無水乙醇室溫，攪拌24小時R2R"R2同為甲基時即為11，13-二氫-13-二甲基氨基小白菊內(nèi)酯，同為乙基時即為11,13-二氫-13-二乙基氨基小白菊內(nèi)酯。11，13-二氫-13-哌啶基-小白菊內(nèi)酯的合成工藝路線反應產(chǎn)物中因存在未反應完全的原料，因此要得到純品小白菊內(nèi)酯衍生物，必須經(jīng)過進一步精制過程，可將反應結(jié)束后的溶劑蒸干，殘留物采用硅膠柱層析精制，用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，TLC或HPLC檢測，收集含小白菊內(nèi)酯衍生物的流份，既得得到純品小白菊內(nèi)酯衍生物，含量為98%以上。經(jīng)修飾后的小白菊內(nèi)酯衍生物，因與N原子相連，成一定程度的堿性，當與酸反應后可制成衍生物鹽，大大提高了其在水中的溶解度，能制成供注射用的藥物，提高了藥物在機體內(nèi)的生物利用度。本發(fā)明的小白菊衍生物的鹽，主要是指無機鹽，優(yōu)選其鹽酸鹽。其鹽酸鹽可以通過如下反應式得到:反應過程中，小白菊內(nèi)酯衍生物鹽酸鹽慢慢析出白色結(jié)晶，分離白色結(jié)晶，既得水溶性小白菊內(nèi)酯衍生物鹽酸鹽。經(jīng)修飾后的小白菊內(nèi)酯衍生物鹽酸鹽，因其水溶性大大增加，可用于制成注射用制劑，如注射液，凍干粉針劑，極大的提高了生物利用度，能更好的起到治療或輔助治療腫瘤、抗白血病的作用。具體實施例本發(fā)明中所用的小白菊內(nèi)酯原料均為星昊醫(yī)藥股份有限公司自制，純度為98%以上。所列舉的實施例不是為了限制本發(fā)明，而是為了更好的說明本發(fā)明，其它工藝類此但原料或用量不同，不會引起實質(zhì)性差異的，也在本發(fā)明之內(nèi)。實施例111，13-二氫-13-二甲基氨基小白菊內(nèi)酯的制備小白菊內(nèi)酯200mg(0.8mraol)，二甲基氨180mg(4咖o1),乙醇鈉476mg(7mmo1)，加入到80mL乙醇中，室溫攪拌24小時，使其充分反應完全，減壓蒸發(fā)溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇50:1-1:l梯度洗脫，TLC或HPLC檢測，收集含11，13-二氫-13-二甲基氨基小白菊內(nèi)酯的流份，最終得216mg產(chǎn)物(得率92%)，化合物純度98.51%?；衔锶埸c142.8-1143.7°C;力-NMR(500MHz,CDC13):S'5.24(1H,d)，3.82(1H，t)，2.76(2H，m)，2.64(1H，dd)，2.53—2.29(3H,m)，2.27(6H，s)，2.20-1.95(5H,m),1.68(3H，s),1.35(3H,s)，1.30-1.16(1H,m);13C—NMR(500MHz，CDCl3):S175.9，134.8，124.2，82.1,66.8,61.9，58.1，47.9，46.5，46.1，40.8，36.2，30.3，24.5,17.8，16.8;EI-MS:M/Z293(M+);UV(MeOH)入max(loge):210nm末端吸收峰(4.03);IRvmax:1776，1462，1377，1136,982cm—1.實施例211，13-二氫-13-哌徒基小白菊內(nèi)酯的制備小白菊內(nèi)酯200mg(0.8翻o1)，哌啶272mg(3.2mmo1)，乙醇鈉476mg(7腿o1)，加入到80mL乙醇中，室溫攪拌24小時，使其充分反應完全，減壓蒸發(fā)溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇50:1-1:l梯度洗脫，TLC或HPLC檢測，收集含11，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯的流份，最終得233mg產(chǎn)物(得率87%)，化合物純度99.26%。實施例311,13-二氫-13-吡啶基小白菊內(nèi)酯的制備小白菊內(nèi)酯200mg(0.8mmo1)，吡啶0.53mL(4.8隨o1)，乙醇鈉476mg(7咖o1)，加入到80mL乙醇中，室溫攪拌24小時，使其充分反應完全，減壓蒸發(fā)溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇50:1-1:l梯度洗脫，TLC或HPLC檢測，收集含11，13-二氫-13-吡啶基小白菊內(nèi)酯的流份，最終得213mg產(chǎn)物(得率81%)，化合物純度98.37%。實施例411，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽的制備11,13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯(10mg)溶于4mL乙醚中，濃鹽酸乙醚液(1M)，緩慢加入到上述乙醚溶液中，至溶液中充滿鹽酸蒸氣，補充加入乙醚溶劑6mL，攪拌，使溶液變?yōu)槌吻?，將澄清溶液?'C冰箱中放置24小時，析出白色結(jié)晶，過濾，濾取結(jié)晶，得ll,13_二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽2.3mg(得率2iyo)。實施例511，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽凍干粉針劑的制備11，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽2.0g甘露醇16g活性炭0.15g注射用水適量將11，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽、甘露醇用蒸餾水溶解，鹽酸或NaOH調(diào)pH為5.07.0，加入活性炭，50。C攪拌30min，過0.22um的微孔濾膜，再通過截留分子量為8000的超濾膜，以注射用水補充溶劑至300mL，分裝，3mL/支，凍干，既得。本品每支含11，13-二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽20mg。實施例611,13-二氫-13-二甲基氨基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽凍干粉針劑的制備11，13-二氫-13-二甲基氨基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽1.5g甘露醇16.5g活性炭0.15g注射用水適量將11,13-二氫-13二甲基氨基-小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽、甘露醇用蒸餾水溶解，鹽酸或NaOH調(diào)pH為5.07.0，加入活性炭，50。C攪拌30min，過0.22um的微孔濾膜，再通過截留分子量為8000的超濾膜，以注射用水補充溶劑至300mL，分裝，3mL/支，凍干，既得。本品每支含11，13-二氫-13二甲基氨基-小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽15mg。實施例711，13-二氫-13-吡啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽凍干粉針劑的制備11，13-二氫-13-吡啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽l.Og甘露醇17g活性炭0.15g注射用水適量將11，13-二氫-13-吡啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽、甘露醇用蒸餾水溶解，鹽酸或NaOH調(diào)pH為5.07.0，加入活性炭，50。C攪拌30min，過0.22咖的微孔濾膜，再通過截留分子量為8000的超濾膜，以注射用水補充溶劑至300mL，分裝，3mL/支，凍干，既得。本品每支含11，13-二氫-13吡啶基-小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽10mg。實施例8藥理實施例(1)、體外藥理作用細胞株白血病細胞株K562、鼻咽癌細胞KB、卵巢癌細胞SKOV3、肝癌細胞BEL-7402、結(jié)腸癌細胞(HT-29)、宮頸癌細胞Hda、前列腺癌細胞PC-3。將處于對數(shù)生長期的的白血病細胞珠K562、鼻咽癌細胞、卵巢癌細胞、肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞、前列腺癌細胞株和LAK細胞(對照組)用CM-1640培養(yǎng)基配成2xl05/ml細胞懸液，加入96孔圓底細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.2ml，再分別加入11，13_二氫-13-哌啶基小白菊內(nèi)酯鹽酸鹽(先以PBS溶解)，使其濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.(Vg/ml，每一測試濃度5孑L置37°C、5%<:02飽和濕度條件下培養(yǎng)72小時，用MTT法在酶聯(lián)檢測儀570nm波長測得吸光(A)值。計算出本發(fā)明提取物對各細胞株的抑制率。抑制率=(1-|||^|)><100%。結(jié)果見表1X寸照組A值表1不同濃度本發(fā)明提取物對腫瘤細胞和LAK細胞的增值抑制率(n/(0—扯本發(fā)明提取物濃度^g/ml)0.250.5鼠骨髓瘤細胞株SP20人白血病細胞株K562鼻咽癌細胞株KB卵巢癌細胞株SK0V3肝癌細胞株BEL7402結(jié)腸癌細胞株HT-20宮頸癌細胞株Hda前列腺癌細胞株PC-3LAK細胞株01111327259303208350187270-21.02.04.02483896689*956581*卯6788*914977*876289*943876*895386*92-2-l2與LAK細胞相比*P<0.01從上表結(jié)果可知，本發(fā)明提取物在0.510ng/ml時，除鼠骨髓細胞瘤、人宮頸癌細胞不產(chǎn)生抑制作用外，其余均有一定的抑制作用，其中以2嗎/ml濃度時最為適宜，再往上梯增濃度對癌細胞的抑制作用貢獻不明顯，無顯著意義。對LAK細胞毒性實驗表明，在0.5~4pg/ml時對LAK細胞不產(chǎn)生抑制作用，在0.5.0~2.0^ig/ml時還有一定的增值作用。—(2)體內(nèi)抗腫瘤實驗癌細胞株結(jié)腸癌細胞株(HT-29)試液PBS標準液取BALB/C小鼠40只，隨機分成4組，分別為對照組，荷HT29癌細胞組三組(分別注射本發(fā)明提取物高、中、低劑量組)、對照組接種HT29結(jié)腸癌細胞株同時腹腔每天注射0.4mlPBS標準液，第給藥治療組于接種HT29細胞懸液后即分別腹腔注射本發(fā)明提取物5、10、15mg/kg.d—1，于接種后第14天解剖存活小鼠，并摘取腫瘤，計算腫瘤體積V-;ab、a最大長徑，b為最大短徑)，并計算抑瘤率，6抑瘤率計算公式為x跳結(jié)果見表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與對照組相比*P<0.01從表2可知，在荷瘤裸鼠體內(nèi)，本發(fā)明提取物對結(jié)腸癌具有抑制腫瘤生長的作用，給藥2周后，治療組小鼠的腫瘤體積明顯小于對照組(PO.Ol)，對腫瘤的抑制成劑量依賴關系，本發(fā)明高劑量組對荷結(jié)腸癌細胞瘤的抑制率別為77.60%。權利要求1.一種小白菊內(nèi)酯衍生物的合成方法，結(jié)構(gòu)式為(I)，其中R可以為二甲基氨基(式II)、哌啶基(式III)或吡啶基(式IV)中的任何一種，其特征在于包括如下步驟(1)、稱取原料小白菊內(nèi)酯和R，其中R的摩爾數(shù)至少為小白菊內(nèi)酯的2倍，另稱取催化劑乙醇鈉適量，三者混合，將其溶解于適量的無水乙醇中，室溫攪拌反應24小時；(2)反應后的溶劑系統(tǒng)蒸干乙醇，殘留物采用硅膠柱層析分離，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，TLC、HPLC檢測洗脫液，收集含小白菊內(nèi)酯衍生物的流份，即得。2、如權利要求1所述的方法，其中所述的原料R可以是二甲基氨、哌啶、吡啶中的任何一種。3、如權利要求1所述的方法，其中R的摩爾數(shù)與小白菊內(nèi)酯的摩爾數(shù)之比優(yōu)選為46:1。4、一種含有治療有效量的如權利要求1所述方法制備得到的小白菊內(nèi)酯衍生物的鹽的凍干粉針注射制劑。5、如權利要求4所述的凍干注射制劑，其中所述的小白菊內(nèi)酯衍生物的鹽主要是指其鹽酸鹽。6、一種制備如權利要求4所述的凍干粉針制劑工藝，其特征在于小白菊內(nèi)酯衍生物鹽酸鹽1020份，甘露醇100-200份，以注射用水溶解，鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH為5-7，加入0.05%~0.1%的活性炭，406(TC攪拌30min，過0.22um的微孔濾膜，再通過截留分子量為8000的濾膜超濾，分裝，凍干即得。全文摘要本發(fā)明涉及小白菊內(nèi)酯衍生物的合成方法。以小白菊內(nèi)酯和含氮化合物為反應原料，乙醇鈉為催化劑，在一定的溶劑和溫度下反應，即可得到本發(fā)明小白菊內(nèi)酯衍生物，衍生物經(jīng)酸化后可得到其鹽，大大提高了其水溶性。經(jīng)修飾后的小白菊內(nèi)酯衍生物鹽可用于制成注射用制劑，更好的發(fā)揮其對腫瘤的治療作用。文檔編號A61K31/4523GK101270102SQ20071011774公開日2008年9月24日申請日期2007年6月22日優(yōu)先權日2007年6月22日發(fā)明者張樹祥,熊國裕申請人:北京星昊醫(yī)藥股份有限公司