專利名稱：胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測胞內(nèi)分枝桿菌感染的變態(tài)反應(yīng)原的制備方法，具體地講，涉及以胞內(nèi)分枝桿菌為原料，在一定條件下將胞內(nèi)分枝桿菌培養(yǎng)后，處理菌體，提取制造胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原。其國際專利分類號C12N1/20。
胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原是檢查非典型分枝桿菌感染的皮膚變態(tài)反應(yīng)試劑，原提取工藝是將菌體經(jīng)10磅20分鐘高壓處理后，從上清液中提取，該工藝產(chǎn)率低而且一些不耐熱蛋白活性被破壞。
本發(fā)明的工藝過程中，將胞內(nèi)分枝桿菌菌體，經(jīng)80—82℃水浴處理，然后將菌體以超聲破碎，從除去殘留菌體后得到的上清液中，以鹽析及酸沉淀法提取變態(tài)反應(yīng)原，提取液經(jīng)膜洗滌除去殘留酸、鹽、無機試劑，得到純化變態(tài)反應(yīng)原。本發(fā)明工藝簡單、變態(tài)反應(yīng)原提取率高，活性高于原提取方法2—3倍。成品可用于人體非典型胞內(nèi)分枝桿菌感染診斷用。該提取方法適用于胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原或其它用于遲發(fā)型皮膚變態(tài)反應(yīng)制劑的制備。
下面是本發(fā)明的技術(shù)方案1、菌液制備將對數(shù)生長期的胞內(nèi)分枝桿菌菌體，轉(zhuǎn)接于固體或液體普通培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2-4周，收集菌體于生理鹽水中。
2、菌體處理菌體置于80℃水浴1小時，離心收集上清液，菌體用生理鹽水稀釋后，以190W超聲破碎，離心收集上清液，將兩次收集上清液合并。
3、上清液中加入硫酸銨，4℃放置12小時，收集沉淀以生理鹽水溶解，后加入三氯醋酸，收集沉淀，以無菌濾膜收集蛋白，以10％NaCl洗滌至無SO42-，加入生理鹽水除菌過濾后即成濃縮制品。
以下是
具體實施例方式1、菌液制備將對數(shù)生長期的胞內(nèi)分枝桿菌菌體，轉(zhuǎn)接于固體或液體普通培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2-4周，收集菌體于生理鹽水中。
2、菌體處理菌體置于80℃水浴1小時，以6000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘收集上清液。菌體用生理鹽水稀釋，以190W超聲破碎(時間為30分鐘共2次)，以6000轉(zhuǎn)/分離心120分鐘收集上清液，將兩次收集上清液合并。
3、向上清液中加入飽和度為70—80％的硫酸銨，4℃放置12小時，過濾收集沉淀，用生理鹽水溶解，然后加入飽和度為3-4％三氯醋酸，收集沉淀，用0.45μ孔徑的硝酸纖維無菌濾膜過濾收集蛋白，以10％NaCl洗滌至無SO42-，加入生理鹽水溶解，除菌過濾后即成濃縮制品。
4、胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原的提取率與活性比較(1)、提取率用我們的工藝提取的PPD-B較國際通用的PPD-Rt23比較，高出2.147倍。
提取率(A)PPD-Rt231.740mg PPD/g 菌體(B)PPD-B 3.736mg PPD/g 菌體B/A＝2.147(2)活性比較劑量 變態(tài)反應(yīng)原均徑(mm)動物標(biāo)化 0.5μg/PPD-B 14.381.0μgDM-PPD 11.19人體標(biāo)化 1μg/標(biāo)準PPD-B 比值(mm)1μg/PPD-B13.9110.311∶2.350.5μg/PPD-B 15.4711.181∶2.380.125μg/PPD-B14.637.69 1∶2.09
權(quán)利要求
1.一種胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原提取方法，其特征是將胞內(nèi)分枝桿菌菌體經(jīng)80-82℃熱處理后菌體以超聲破碎，取無菌體濾液，以鹽析及酸沉淀法提取變態(tài)反應(yīng)原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是該變態(tài)反應(yīng)原方法可以是胞內(nèi)分枝桿菌或其它用于遲發(fā)型皮膚變態(tài)反應(yīng)制劑的制備。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于提取胞內(nèi)分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原的新方法。把經(jīng)固體或液體培養(yǎng)的胞內(nèi)分枝桿菌菌體，經(jīng)80—82℃加熱處理，菌體以超聲破碎后經(jīng)酸沉淀，及鹽析提取變態(tài)反應(yīng)原。該方法工藝簡單、變態(tài)反應(yīng)原提取率高，活性高于原提取方法2—3倍。成品可用于人體非典型胞內(nèi)分枝桿菌感染診斷用。
文檔編號A61K39/35GK1118271SQ9510677
公開日1996年3月13日 申請日期1995年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月27日
發(fā)明者趙桂芳, 王國治, 沈小兵 申請人:中國藥品生物制品檢定所