專利名稱：一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療、預防輪狀病毒感染生物新藥的制備以及開發(fā)，特別是抗輪狀病毒卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途。
背景技術：
腹瀉病是我國兒童的高發(fā)病，約占兒科總住院人數(shù)的12% 24%，其中8 12月以輪狀病毒引起的秋季腹瀉為主。應用抗輪狀病毒雞卵黃免疫球蛋白(IgY)治療輪狀病毒性腸炎，為采用被動免疫保護及治療輪狀病毒性腸炎提供了一條新途徑。但迄今為止，注射仍然是這類藥物臨床應用的唯一給藥途徑，存在突出問題是·藥物在血液中半衰期短，需長期頻繁注射，造成患者在身體、精神、經(jīng)濟上的極大負擔，患者治療依從性差； 注射劑型生產(chǎn)條件苛刻，需嚴格控制熱源、內毒素等指標，造成工藝復雜，生產(chǎn)成本高；·由于無載體保護，藥物貯運條件苛刻，貯運成本高等，這些問題最終會限制IgY抗體藥物產(chǎn)品的品種與市場。因此，發(fā)展該藥物非注射給藥途徑是當前國內外醫(yī)藥界共同關注的重大課題，也是世界性難點。可能的非注射給藥途徑有吸入給藥、粘膜給藥、眼部給藥、口服給藥等。其中，口服給藥因方便、安全而成為國際抗體藥物的發(fā)展前沿，但面臨的重大難題是·藥物直接口服易被胃酸及消化道酶降解； 作為水溶大分子，藥物釋放難以控制。
針對上述難題，目前采取的研究對策有·添加蛋白酶抑制劑； 腸溶包衣；籲結腸給藥； 微囊載體等。其中，生物微囊技術可能是實現(xiàn)蛋白質藥物口服給藥最有希望的解決途徑。生物微囊技術是由天然或合成的高分子材料通過生物材料相互作用，制備成微囊這種多單元劑型，延長與胃腸道的接觸時間，從而達到緩慢釋放的目的；微囊膜具有選擇通透特性，可控制不同分子的釋放；保護微囊內生物分子的酶解、酸堿降解。理論分析及實踐表明，在小腸，粒徑< ΙΟμπι顆粒性物質可通過約占小腸面積25%的集合淋巴小結(即 peyer’ s小結)快速吸收入血。peyer’ s小結中 ，微皺折細胞(即M細胞)是吸收轉運微粒的功能細胞。當微粒在腸腔被M細胞內吞后，通過囊性轉運方式被轉運到M細胞基底面凹腔釋出，經(jīng)淋巴管進入胸導管，再匯總到上腔靜脈，進入體循環(huán)。因此，如果將IgY藥物包封在粒徑< IOym的微球載體中，既能保護藥物在口服途徑中不被降解，還能攜帶藥物通過小腸上皮吸收屏障。
針對上述問題，本項目利用家禽受到外來抗原(細菌、病毒等微生物)的刺激會產(chǎn)業(yè)免疫應答并生成相應抗體且抗體主要沉積在雞蛋的蛋黃中這一特點，以產(chǎn)蛋母雞作為生物反應器，大量、連續(xù)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)卵黃免疫球蛋白，為生產(chǎn)無公害、無污染的保健食品、生物制品和藥物提供源頭材料。同時針對抗輪狀病毒雞卵黃免疫球蛋白口服給藥面臨的重大難題(消化道酶屏障及酸屏障)，結合中科院大連化學物理研究所天然多糖基生物微囊技術在有效屏蔽消化道酶、釋放控制、黏附可控性方面優(yōu)勢籲殼聚糖、海藻酸鈉來源廣、成本低，符合載藥微囊規(guī)?；邪l(fā)需求； 改性殼聚糖、海藻酸鈉能在全生理條件下快速形成微球控釋膜，實驗表明該膜能截留胃蛋白酶、胰蛋白酶，而微球中藥物能通過膜控制釋放；同時，該膜能保護生物質免受胃酸破壞(例與游離狀態(tài)相比，微囊化酵母細胞GS115在胃酸中存活率可提高200倍以上)，進行IgY 口服制劑的研究，為實現(xiàn)IgY 口服制劑的產(chǎn)品性能提升提供技術支撐。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是要提供一種安全、可靠、經(jīng)濟簡便、易于推廣適用面廣的針對輪狀病毒的卵黃IgY抗體微囊制劑及其制備方法與應用。
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，它是由輪狀病毒制備的疫苗，注射到健康產(chǎn)卵的雌禽體內，經(jīng)此免疫后，取卵黃經(jīng)除菌、分離提取，純化得到抗輪狀病毒的IgY 制劑或將含多種輪狀病毒的IgY抗體制劑按比例混合，將混有IgY抗體的海藻酸鹽溶液以液滴的方式加入到殼聚糖的混合液中，制備成凝膠態(tài)的AP微囊，即抗輪狀病毒卵黃抗體微囊制劑。
—種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其微囊結構分為微囊膜與內核心部分其中，微囊膜由海藻酸鹽、殼聚糖形成的聚電解質復合水凝膠膜；內核為含有IgY抗體的海藻酸鹽液體環(huán)境。·
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其微囊膜由海藻酸鹽、殼聚糖兩種高分子材料通過聚電解質絡合反應形成水凝膠膜?？贵w微囊的制備方法如下步驟
(I)包埋有純化IgY的海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球；
(2)將步驟(I)中的A微球以液滴的方式加入殼聚糖溶液中，將殼聚糖用于海藻酸鹽膠囊緩釋的包被膜，A微球與殼聚糖溶液體積比例同為1:1 1: 40，反應I 60分鐘，反應溫度在O 37°C，此時得到AP微囊取出用生理鹽水洗滌。
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其微囊產(chǎn)品的膜成分中的海藻酸鹽為海藻酸的鉀鹽或鈉鹽。
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其抗輪狀病毒卵黃抗體的制備方法如下步驟
(I)取一種或多種輪狀病毒種子毒株經(jīng)復蘇傳代，培養(yǎng)增殖輪狀病毒，制成輪狀病毒疫苗；
(2)雌禽適應性飼養(yǎng)，正常產(chǎn)卵一周后，將步驟A制成的疫苗以一定的抗原量進行免疫，加弗氏佐劑，每次O. 5mL,皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，免疫2 4次，一般抗輪狀病毒的IgY抗體在第一次免疫14天后出現(xiàn)，收集卵蛋，4°C保存，隔30天可加強免疫一次；
(3)采用步驟B疫苗免疫后的卵蛋，用75%的酒精消毒上述疫苗免疫后的卵黃外殼，去殼，去卵黃膜，取出卵黃，得到該抗輪狀病毒的IgY抗體。
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其抗輪狀病毒卵黃抗體分離、純化的制備方法如下步驟
(I)取卵黃，巴氏消毒，直接凍干，制成含有輪狀病毒IgY抗體的蛋黃粉；
(2)取卵黃，采用水稀釋法(WD)法，或聚乙二醇(PEG)法，或硫酸葡聚糖法，或有機溶劑抽提法，或自然膠(藻酸鈉、角叉菜膠)法，或乙醇沉淀法等方法，進行分離和提取輪狀病毒的IgY抗體，采用層析法，或透析法或超濾法等方法進行純化，利用DEAE-Sepharose F. F離子交換層析柱或親和層析法進一步純化IgY，制得純的輪狀病毒IgY抗體液。
IgY抗體微囊制劑，在輪狀病毒感染性疾病的被動免疫治療中的應用。
IgY抗體微囊制劑，在高危人群預防輪狀病毒的感染中的應用。
上述IgY抗體微囊制劑，4 °C保存，備用。
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途
(I)在治療或預防抗輪狀病毒感染引起的相關疾病
將含有輪狀病毒IgY抗體的蛋黃粉添加于食品或制成保健食品，或直接服用輪狀病毒IgY抗體制成的微囊，是針對該抗輪狀病毒感染引起的相關疾病的治療方法。此外，抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑也可作為輔助治療法，該輪狀病毒患者在常規(guī)化療藥物方案治療期間可同時服用，增強免疫力。
對健康人群尤其對與輪狀病毒患者密切接觸的高危人群，服用含抗輪狀病毒IgY 抗體的微囊制劑，可以預防輪狀病毒的感染。將多種輪狀病毒的IgY抗體微囊制劑按比例混合，制成復合型IgY抗體微囊制劑，應用于高危人群預防輪狀病毒的感染。
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用實時抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑治療或輔助治療輪狀病毒，能克服抗輪狀病毒變異性，多態(tài)性，易產(chǎn)生抗藥性等突出的問題。
雌禽產(chǎn)生有效免疫所需抗原量小，易于飼養(yǎng)，卵蛋收集方便，治療費用低，治療效果好，無明顯的不良反應，是一種安全、高效、經(jīng)濟簡便、易于推廣，無交叉性、不會破壞微生態(tài)平衡、適用面廣的的生物制劑，是輪狀病毒病治療藥物及治療方法的新突破。
具體實施例方式
通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例，可以進一步清楚地了解本發(fā)明的內容，但它們不是對本發(fā)明的限定 。
實施例1:
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途包括如下步驟
(一)免疫:
選用健康母雞，適應性飼養(yǎng)，正常產(chǎn)蛋一周后，開始免疫。注射加弗氏佐劑的輪狀病毒疫苗，每次O. 5mL，皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，共4次，抗體一般在第一次免疫 14天后出現(xiàn)。隔30天加強免疫一次，收集雞蛋，4°C保存；
( 二)抗體純化與分離制備
將上述雞蛋外殼用75%酒精消毒，無菌環(huán)境中去殼、去卵黃膜，取卵黃，采用下述方法進行抗體制劑的制備；方法一卵黃巴氏消毒，凍干，制成含輪狀病毒IgY抗體的卵黃粉，4°C保存；方法二 用WD法純化卵黃抗體蛋白質，用微孔濾膜過濾，除菌，4°C保存；方法三用WD法純化卵黃抗體蛋白質，調節(jié)pH4. 6 6. 0，凍融預處理后微濾(O. 45IULm)，5倍超濾濃縮，對超濾截留液用25%飽和硫酸銨鹽析，經(jīng)離速冷凍離心，得到IgY沉淀，PBS溶解，透析脫鹽，經(jīng)DEAE-Sepharose F. F離子交換層析柱法進一步純化IgY，制得高純度的輪狀病毒IgY抗體液，4°C保存。
(三)抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑的制備
(I)將定量的純化IgY包埋于海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球；
(2)將步驟(I)中的A微球以液滴的方式加入殼聚糖溶液中，將殼聚糖用于海藻酸鹽膠囊緩釋的包被膜，A微球與殼聚糖溶液體積比例同為1: 5，反應60分鐘，反應溫度37°C，此時得到AP微囊取出用生理鹽水洗滌，即為抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑。
實施例2
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途包含如下步驟
( 一 )免疫
選用健康母雞，適應性飼養(yǎng)，正常產(chǎn)蛋一周后，開始免疫。注射加弗氏佐劑的滅活輪狀病毒疫苗，每次O. 5mL，皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，共4次，抗體一般在第一次免疫14天后出現(xiàn)。隔30天加強免疫一次，收集雞蛋，4 C保存；
( 二)抗體純化與制備
將上述雞蛋外殼用新潔爾滅消毒，去殼、去卵黃膜，取卵黃，采用下述方法進行抗體制劑的制備；方法一卵黃巴氏消毒，凍干，制成含輪狀病毒IgY抗體的卵黃粉，4°c保存； 方法二 用WD法純化卵黃抗體蛋白質，用微孔濾膜過濾，除菌，4°C保存；方法三用WD法純化卵黃抗體蛋白質，調節(jié)PH6. O,凍融預處理后用微孔濾膜微濾，10倍超濾濃縮，對超濾截留液用45%飽和硫酸銨鹽析，經(jīng)離速冷凍離心，得到IgY沉淀，PBS溶解，透析脫鹽，經(jīng) DEAE-Sepharose F. F離子交換層析柱法進一步 純化IgY，制得高純度的輪狀病毒IgY抗體液，4°C保存。
(三)抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑的制備
(I)將定量的純化IgY包埋于海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球；
(2)將步驟(I)中的A微球以液滴的方式加入殼聚糖溶液中，將殼聚糖用于海藻酸鹽膠囊緩釋的包被膜，A微球與殼聚糖溶液體積比例同為1: 8，反應30分鐘，反應溫度 30°C，此時得到AP微囊取出用生理鹽水洗滌，即為抗輪狀病毒IgY抗體微囊制劑。
實施例3
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途
口服輪狀病毒IgY抗體制成微囊是針對輪狀病毒感染引起的相關疾病的治療藥物，每天使用IgY抗體微囊，一個月為I療程。是針對輪狀病毒感染引起的相關疾病的治療方法。根據(jù)需要，可進行多個療程的治療。含輪狀病毒IgY抗體的蛋黃粉添加于食品或制成保健食品，可作為輔助治療法，患者在常規(guī)化治療藥物方案治療同時可服用，以增強對輪狀病毒的抵抗力。
實施例4
一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途
對健康人群尤其對于與輪狀病毒患者密切接觸的高危人群，服用含抗輪狀病毒 IgY抗體的蛋黃粉添加于食品或制成保健食品，可以預防輪狀病毒的感染。
實施例5
除了免疫對象采用鴨外，其他過程同以上實施例1。
實施例6
除了免疫對象采用鵪鶉外，其他過程同以上實施例1。
權利要求
1.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，其特征是它是由輪狀病毒制備的疫苗，注射到健康產(chǎn)卵的雌禽體內，經(jīng)此免疫后，取卵黃經(jīng)除菌、分離提取，純化得到抗輪狀病毒的IgY制劑或將含多種輪狀病毒的IgY抗體制劑按比例混合，將混有IgY抗體的海藻酸鹽溶液以液滴的方式加入到殼聚糖的混合液中，制備成凝膠態(tài)的AP微囊，即抗輪狀病毒卵黃抗體微囊制劑。
2.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，根據(jù)權利要求1所述，其特征是微囊結構分為微囊膜與內核心部分；其中，微囊膜由海藻酸鹽、殼聚糖形成的聚電解質復合水凝膠膜；內核為含有IgY抗體的海藻酸鹽液體環(huán)境。
3.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，根據(jù)權利要求2所述，其特征是微囊膜由海藻酸鹽、殼聚糖兩種高分子材料通過聚電解質絡合反應形成水凝膠膜?？贵w微囊的制備方法如下步驟(1)包埋有純化IgY的海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球；(2)將步驟(I)中的A微球以液滴的方式加入殼聚糖溶液中，將殼聚糖用于海藻酸鹽膠囊緩釋的包被膜，A微球與殼聚糖溶液體積比例同為1:1 1: 40，反應I 60分鐘，反應溫度在O 37°C，此時得到AP微囊取出用生理鹽水洗滌。
4.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，按照權利要求2或3所述的微囊，其特征在于微囊產(chǎn)品的膜成分中的海藻酸鹽為海藻酸的鉀鹽或鈉鹽。
5.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，根據(jù)權利要求1所述，抗輪狀病毒卵黃抗體的制備方法如下步驟(1)取一種或多種輪狀病毒種子毒株經(jīng)復蘇傳代，培養(yǎng)增殖輪狀病毒，制成輪狀病毒疫苗；(2)雌禽適應性飼養(yǎng)，正常產(chǎn)卵一周后，將步驟A制成的疫苗以一定的抗原量進行免疫，加弗氏佐劑，每次O. 5mL,皮下或肌肉注射，每7天免疫一次，免疫2 4次，一般抗輪狀病毒的IgY抗體在第一次免疫14天后出現(xiàn)，收集卵蛋，4°C保存，隔30天可加強免疫一次；(3)采用步驟B疫苗免疫后的卵蛋，用75%的酒精消毒上述疫苗免疫后的卵黃外殼，去殼，去卵黃膜，取出卵黃，得到該抗輪狀病毒的IgY抗體。
6.一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，抗輪狀病毒卵黃抗體分離、純化的制備方法如下步驟(1)取卵黃，巴氏消毒，直接凍干，制成含有輪狀病毒IgY抗體的蛋黃粉；(2)取卵黃，采用水稀釋法(WD)法，或聚乙二醇(PEG)法，或硫酸葡聚糖法，或有機溶劑抽提法，或自然膠(藻酸鈉、角叉菜膠)法，或乙醇沉淀法等方法，進行分離和提取輪狀病毒的IgY抗體，采用層析法，或透析法或超濾法等方法進行純化，利用DEAE-Sepharose F. F 離子交換層析柱或親和層析法進一步純化IgY，制得純的輪狀病毒IgY抗體液。
7.權利要求1所述IgY抗體微囊制劑，在輪狀病毒感染性疾病的被動免疫治療中的應用。
8.權利要求1所述復合型IgY抗體微囊制劑，在高危人群預防輪狀病毒的感染中的應用。
全文摘要
發(fā)明公開了一種卵黃抗體微囊制劑的制備方法及用途，它是由輪狀病毒制備的疫苗，注射到健康產(chǎn)卵的雌禽體內，經(jīng)此免疫后，取卵黃經(jīng)除菌、分離提取，純化得到抗輪狀病毒的IgY制劑或將含多種輪狀病毒的IgY抗體制劑按比例混合，將混有IgY抗體的海藻酸鹽溶液以液滴的方式加入到殼聚糖的混合液中，制備成凝膠態(tài)的AP微囊，即抗輪狀病毒卵黃抗體微囊制劑。用于該輪狀病毒病感染患者的被動免疫治療，及高危人群預防輪狀病毒。
文檔編號A61K39/395GK102988329SQ20111027281
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權日2011年9月15日
發(fā)明者趙鋼, 王智佳, 王國新 申請人:天津濟命生生物科技有限公司