專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用固相多肽合成法合成四肽異構(gòu)體的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種四肽異構(gòu)體的制備方法，具體的說(shuō)本發(fā)明涉及一種利用固相多肽合成法合成四異構(gòu)體的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
N-乙酰基-絲氨酸-天冬氨酸-賴(lài)氨酸-脯氨酸(N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro)， 簡(jiǎn)寫(xiě)為Ac-S-D-K-P，它是一個(gè)氮端乙?；膬?nèi)源性四肽，廣泛分布于體內(nèi)各種組織及體液中。這個(gè)四肽主要由它的前體物胸腺素β 4經(jīng)由脯氨酰寡肽酶(POP)水解而釋放。在血液中的濃度一般為納摩爾級(jí)。Ac-S-D-K-P的藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Ac-S-D-K-P靜脈注入體內(nèi)后，很快就被降解，半衰期僅為4 5min。Ac-S-D-K-P在人體內(nèi)通過(guò)兩種機(jī)制從血漿中清除①血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)介導(dǎo)的水解作用；②腎小球?yàn)V過(guò)作用。其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)介導(dǎo)的水解作用是Ac-S-D-K-P代謝的主要途徑。Ac-S-D-K-P是一種多功能性生理調(diào)控因子，具有多種生物學(xué)活性。早期報(bào)道， Ac-S-D-K-P可以通過(guò)阻止原始造血干細(xì)胞進(jìn)入S期，使其靜止在GO期，而抑制造血干細(xì)胞的活性。隨后發(fā)現(xiàn)Ac-S-D-K-P通過(guò)促進(jìn)血管的生成可以提高表皮的再植能力，加速受損的無(wú)血管表皮移植的傷口愈合。Ac-S-D-K-P能夠抑制MGM刺激的骨髓干細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，從而起到抗炎作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Ac-S-D-K-P對(duì)多種細(xì)胞的增殖具有抑制作用。Ac-S-D-K-P是一種重要的抗多種器官纖維化的因子。Ac-S-D-K-P能抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成。研究發(fā)現(xiàn)Ac-S-D-K-P對(duì)PDGF介導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成均有抑制作用；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，Ac-S-D-K-P可能通過(guò)抑制血清中諸多因子或活性成分而發(fā)揮其抑制血清誘導(dǎo)刺激的心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成及表達(dá)的作用，這可能與抗心臟纖維化的作用有關(guān)。除心臟纖維化以外，目前的研究在Ac-S-D-K-P對(duì)腎臟、肝臟、肺臟等器官纖維化方面，都能發(fā)揮一定的抗器官纖維化的活性。Ac-S-D-K-P具有非常顯著的抗纖維化和抗炎的特點(diǎn)，但由于其進(jìn)入人體后，在體內(nèi)ACE的作用下迅速降解，使其濃度大大下降，極大地限制了其生物活性的發(fā)揮。因此，提供一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠抵抗體內(nèi)ACE的降解作用并持久發(fā)揮其生物學(xué)功能的Ac-S-D-K-P類(lèi)短肽具有重要意義，而截止目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種固相多肽合成四肽的方法，用本發(fā)明方法所合成的Ac-S-D-K-P的異構(gòu)體，通過(guò)對(duì)部分氨基酸殘基進(jìn)行D型改構(gòu)，使其能夠抵抗體內(nèi)ACE的降解作用，并能夠持久發(fā)揮其生物學(xué)功能。為實(shí)現(xiàn)第一目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的異構(gòu)體的方法，所述的異構(gòu)體包括 N-Acetyl-Ser-(d) Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp- (d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser- (d) Asp-(d)Lys-Pro，所述的方法包括
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以三苯氯甲基型樹(shù)脂中的任一種為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸，獲得四肽樹(shù)脂；其間依次脫去芴甲氧羰?；Ｗo(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)的四肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得四肽異構(gòu)體粗品，并經(jīng)C18或C8色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所述的四肽異構(gòu)體。其中，所述的方法包括四肽樹(shù)脂的制備(1)制備 Fmoc-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂以三苯氯甲基樹(shù)脂、4-甲基-三苯氯甲基樹(shù)脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹(shù)脂、 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂中的一種作為起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡 10-60分鐘，其中，樹(shù)脂的重量體積濃度為5-20ml/g ；在上述的樹(shù)脂中，依次加入DIEA 或 DMAP、Rnoc-Pro-0H 或 Rnoc-D-Pro-OH，10-50 °C 反應(yīng)0. 5-5小時(shí)，所得樹(shù)脂分別用異丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗滌、獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Pro-樹(shù)月旨；(2)制備 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟(1)所得Fmoc-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60 分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次，加入用重蒸餾的DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -OH 或 Fmoc-D-Lys (Boc) -0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/ HOBt的混合物，10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次， 抽干，獲得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(3)制備 Fmoc-D-Asp (otBu) - Lys (Boc) - Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟( 所得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10_50°C反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-500C 反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入用重蒸餾的 DMF 溶解的 Fmoc-D-Asp (otBu) -OH 或 Fmoc-Asp (otBu) -OH、DIEA、TBTU/ HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10-50 °C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干，獲得Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨；(4)制備 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tBu) -As ρ (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟(3)所得Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑 10-50 °C 反應(yīng) 5-30 分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF 洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入用重蒸餾的DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10_50°C反應(yīng) 10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干；(5)制備 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟(4)所得 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10_50°C反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2 次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10_50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次、DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分鐘，抽干，用氮?dú)獯蹈呻臉?shù)脂成干顆粒，得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Bo c) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(6)制備四肽異構(gòu)體粗品將步驟5吹干后的樹(shù)脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20_10°C的切肽試劑，所述的切肽試劑為T(mén)FA/EDT/H20/Thio的復(fù)合液，其中四者件的體積比為 90-95/2-5/2-5/1-5，10°C _50°C反應(yīng)1-5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀， 離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1-6次，低溫冷凍干燥IO-M小時(shí)，獲得四肽異構(gòu)體粗品，所述切肽試劑中，樹(shù)脂的濃度為5-50ml/g。優(yōu)選所述的步驟1中，DIEA或DMAP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2_20倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1-10倍；反應(yīng)溶液中，樹(shù)脂的濃度為0. l-5ml/g。優(yōu)選所述的步驟2-5中，所述的脫帽試劑的組分和體積比為PIP DMF = 1 2-5。優(yōu)選所述的步驟2-4中，F(xiàn)moc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Ser (tBu) -OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的1-5倍；Fmoc-Pro-樹(shù)脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5_20ml/ g ；TBTU/HBTU/B0P的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2_5倍；H0Bt/H0At摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2-5倍。優(yōu)選所述的步驟2中Fmoc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Ser (tBu) -OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的1-5倍；Fmoc-Pro-樹(shù)脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-20ml/g ； 所述的步驟3中，F(xiàn)moc-D-Asp (otBu)-OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2_5倍；所述的步驟5中，乙酸酐體積為樹(shù)脂的重量的1-2倍。優(yōu)選所述的步驟1在反應(yīng)結(jié)束后再加入封閉試劑甲醇或苯甲酰氯吡啶10-50°C反應(yīng)0. 2-3小時(shí)，所得樹(shù)脂分別用異丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗滌、獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Pro-樹(shù)月旨。所述的四肽異構(gòu)體粗品經(jīng)C18或C8色譜柱分離純化的方法包括如下步驟將四肽異構(gòu)體粗品溶于水溶液中，過(guò)濾，濾液經(jīng)C18或C8色譜柱純化，流動(dòng)相有兩種A:0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；線性梯度洗脫；流速為l-150ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215-285nm ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，分析，獲得四肽異構(gòu)體純品。以下對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)介紹本發(fā)明公開(kāi)了一種固相多肽四肽異構(gòu)體的制備方法，所述方法以三苯氯甲基型樹(shù)脂為合成樹(shù)脂，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)的氨基酸，獲得保護(hù)的四肽異構(gòu)體樹(shù)脂，其間依次脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或B0P/H0Bt或B0P/H0At 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt 或 HATU/HOBt 或 HATU/HOAt 或 HCTU/HOBt 其中的一種為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的四肽異構(gòu)體樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得四肽異構(gòu)體粗品，并經(jīng)C18或C8色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所需的四肽異構(gòu)體。本發(fā)明所述的四肽異構(gòu)體為N-Acetyl-Ser-(d) Asp-Lys-Pro、 N-Acetyl-Ser-Asp-(d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser-(d)Asp-(d)Lys_Pro，本說(shuō)明書(shū)中，以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)為四肽異構(gòu)體①、異構(gòu)體②和異構(gòu)體③。本發(fā)明所使用的各試劑，均可采用現(xiàn)有市售的產(chǎn)品，供應(yīng)商如四川三高生化股份有限公司及上?；瘜W(xué)試劑公司等。本發(fā)明要求保護(hù)一種四肽異構(gòu)體的合成方法，該方法優(yōu)選包括采取封閉剩余位點(diǎn)的步驟，以減少雜肽的產(chǎn)生，利于純化。此外，發(fā)明人在大大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，最終確定了一種最佳的合成路線及反應(yīng)條件，最終得到了穩(wěn)定性好、純度和收率高的四肽異構(gòu)體。按照本發(fā)明，依次連接具有保護(hù)集團(tuán)的氨基酸，獲得四肽異構(gòu)體樹(shù)脂，其間依次脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)的方法及乙?；ㄒ韵虏襟E(1)制備 Fmoc-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂以三苯氯甲基型樹(shù)脂作樹(shù)脂，用N，N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分鐘， 混合物中，樹(shù)脂的重量體積濃度為5-20ml/g ；然后在上述的樹(shù)脂中，加入DIEA 或 DMAP、Rnoc-Pro-0H 或 Rnoc-D-Pro-OH，10-50 °C 反應(yīng)0. 5-5小時(shí)，再加入封閉試劑甲醇或吡啶苯甲酰氯10-50°C反應(yīng)0. 2-3小時(shí)，樹(shù)脂用異丙醇洗滌、N, N- 二甲基甲酰胺，獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂；其中DIEA或DMAP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2_20倍；
Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的1_5倍反應(yīng)溶液中，樹(shù)脂的濃度為0. l-5ml/g ；(2)制備 Fmoc-Lys (Boc) -OH 樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟(1)的Fmoc-Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10-50 °C 反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑， 沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，加入用重蒸餾的DMF溶解的Fmoc-Lys (Boc) -OH或 Fmoc-D-Lys (Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10-50 "C 反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加
茚三酮試劑，沸水中加熱:3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，獲得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨；所述的脫帽試劑的組分和體積比為=PIP DMF = 1 2-5，下同；Fmoc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的 1-5 倍；Fmoc-Pro-樹(shù)脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5_20ml/g ；TBTU/HBTU/B0P的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2_5倍；H0Bt/H0At摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2_5倍；茚三酮試劑配方5%的無(wú)水乙醇溶液；(3)制備 Fmoc-D-Asp (otBu) - Lys (Boc) - Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟⑵所得樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟(2)；加入用重蒸餾的 DMF 溶解的 RiiOc-D-Asp(OtBu)-OH 或 Rnoc-Asp (otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10_50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次， DMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加細(xì)1茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，抽干，獲得 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-豐對(duì)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-豐對(duì)月旨；Fmoc-D-Asp (otBu) -OH或Fmoc-Asp (otBu) -OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的 1-5 倍；其余操作以及工藝條件同上；(4)制備 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tBu) -As ρ (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟(3)的Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟O)；加入用重蒸餾的 DMF 溶解的 Fmoc-Ser (tBu) -OH 或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10_50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2 次，DMF洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性；(5)制備 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂(肽的乙?；?在步驟的 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tB u) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟O)；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次、DMF 洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分鐘，抽干，用氮?dú)獯蹈呻臉?shù)脂成干顆粒，所得到的肽樹(shù)脂為Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或Ac-S er (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro -樹(shù)脂；其中，乙酸酐體積為樹(shù)脂的重量的1-2倍；按照本發(fā)明，對(duì)獲得的四肽異構(gòu)體樹(shù)脂，需進(jìn)行切割分離，得到四肽異構(gòu)體粗品。 其按以下步驟進(jìn)行把吹干的 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ο tBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20-10°C的切肽試劑(TFA/EDT/H20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5， 體積比)，IO0C -50°C反應(yīng)1-5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1-6次，低溫冷凍干燥IO-M小時(shí)，獲得四肽異構(gòu)體粗品；切肽試劑中，樹(shù)脂的濃度為5-50ml/g。按照本發(fā)明，對(duì)得到四肽異構(gòu)體粗品，需進(jìn)行分離純化，粗品經(jīng)C18或C8色譜柱純化的方法包括如下步驟將四肽異構(gòu)體粗品溶于水溶液中，過(guò)濾，濾液經(jīng)C18或C8色譜柱純化，流動(dòng)相有兩種A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為 l-150ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215-285nm ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，分析，獲得四肽異構(gòu)體純品(MW 487. 5)。
本發(fā)明還要求保護(hù)一種含有上述四肽異構(gòu)體的凍干粉針劑，所述的凍干粉針劑可采用現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的各種制備方法制備而成。具體制備方法的選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。此外，本發(fā)明要求保護(hù)的四肽異構(gòu)體還可以進(jìn)一步制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。此外，上述凍干粉針劑及其他劑型中還可以進(jìn)一步含有一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。 所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。上述藥物的用量以四肽異構(gòu)體的用量記，一般為每天800 μ g/kg體重。本發(fā)明的四肽異構(gòu)體合成工藝路線有以下特點(diǎn)原輔材料來(lái)源方便，工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，收率高，純度好，質(zhì)量穩(wěn)定，可規(guī)?；a(chǎn)，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。采用上述合成方法，本發(fā)明能夠得到高純度和產(chǎn)率的四肽異構(gòu)體。


圖1為實(shí)施例1中四肽異構(gòu)體粗品色譜圖；圖2為實(shí)施例1中四肽異構(gòu)體純化圖；圖3為實(shí)施例1中四肽異構(gòu)體純品色譜圖；圖4為實(shí)施例2中四肽異構(gòu)體粗品色譜圖；圖5為加入陰性抗體的裸細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D6為陽(yáng)性對(duì)照組，不加藥物處理圖7為異構(gòu)體①處理組圖8為異構(gòu)體②處理組圖9為異構(gòu)體③處理組圖10為四肽異構(gòu)體對(duì)細(xì)胞增殖的影響
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，將有助于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)及效果有更進(jìn)一步的了解，此處僅例舉最具代表性的實(shí)施方式，但實(shí)施例不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求決定。實(shí)施例1四肽異構(gòu)體的合成方法以5g 二氯樹(shù)脂為起點(diǎn)的四肽異構(gòu)體①(N-Acetyl-kr-(d)ASp-LyS-PrO-C00H)合成過(guò)程為例1.肽樹(shù)脂的合成(1)制備 Fmoc-Pro-樹(shù)脂稱(chēng)取5克2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分鐘，在上述的樹(shù)脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH, 25°C反應(yīng)2小時(shí)，再加入封閉試劑甲醇 1. 5ml，25°C反應(yīng)2小時(shí)，樹(shù)脂用35ml異丙醇洗滌兩次、再用35ml N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF) 洗兩次，獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂；(2)制備 Fmoc-Lys (Boc) -OH 樹(shù)脂
9
在步驟(1)的Fmoc-Pro-樹(shù)脂中，加入35ml脫帽試劑，25 °C反應(yīng)10分鐘，用真空泵抽干，重新加入35ml脫帽試劑25 °C反應(yīng)30分鐘，抽干，用35ml異丙醇洗滌2次， 35mlDMF洗滌2次，重蒸餾的35mlDMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。加入用重蒸餾的DMF溶解的4. 69gFmoc-Lys (Boc) _0H、2mlDIEA、 3. 22gTBTU、5mlH0Bt的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF 洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性。獲得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨；所述的脫帽試劑的組分和體積比為=PIP DMF = 1 2. 5，下同；(3)制備 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟O)的Fm0c-Lys(B0c)-Pr0-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟(2)；加入用重蒸餾的 DMF 溶解的 4. 12g Fmoc-D-Asp (otBu)-0H、2mlDIEA、3. 22gTBTU、 5mlH0Bt的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加細(xì)1茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性。獲得Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；其余操作以及工藝條件同上； (4)制備 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟(3)的Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟(2)；加入用重蒸餾的DMF溶解的3. 84g Fmoc-Ser (tBu)-OH、2mlDIEA、 3. 22gTBTU,2mlH0Bt的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，獲得Fmoc -Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨；(5)制備 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂(肽的乙?；?在步驟的 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟O)；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次、DMF洗滌2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分鐘，抽干，用氮?dú)獯蹈呻臉?shù)脂成干顆粒，所得到的肽樹(shù)脂為獲得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (B oc) -Pro-樹(shù)脂；2.肽樹(shù)脂的切割分離把吹干的Ac-Ser (tBu)-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂倒入玻璃的切割瓶中， 加入預(yù)冷至_20°C的切肽試劑(TFA H2O = 95 5，體積比)80ml，20°C反應(yīng)1. 5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，加-20°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用冷乙醚洗滌1次，低溫冷凍干燥16 小時(shí)，獲得四肽異構(gòu)體粗品2. Ig ；3.對(duì)四肽異構(gòu)體粗品的分離純化(1)樣品準(zhǔn)備將四肽異構(gòu)體粗品溶于水溶液中，過(guò)濾，備用。(2)四肽異構(gòu)體粗品HPLC分析取濾液20 μ 1用HPLC分析，色譜條件CW色譜柱 (Hypersil-0DS2, Φ5· 4. 6X250mm)，流動(dòng)相:A :0. 三氟乙酸力口 99. 9%/jC ；B :0. 1%H 氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm ；色譜圖見(jiàn)圖1。(3)四肽異構(gòu)體粗品HPLC純化
取濾液3ml 用 HPLC 純化，選用 C18 色譜柱(Hypersil_0DS2，Φ5· 10X250mm)， 流動(dòng)相A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為lOml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm ；收集目標(biāo)峰液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得四肽異構(gòu)體純品1. 56g。純化色譜圖見(jiàn)圖2。(4)四肽異構(gòu)體純品分析取少量樣品，配成0. 5mg/ml，過(guò)濾，取20μ 1用HPLC分析，條件同四肽異構(gòu)體粗品 HPLC分析條件，色譜圖見(jiàn)圖3。本實(shí)施例中，N-AcetyHer-(d)Asp-Lys-Pro粗品的純度為91. 8670%，收率為 74.3%,純度為98% (HPLC歸一化法)。實(shí)施例2四肽異構(gòu)體的合成方法(未封閉)以5g 二氯樹(shù)脂為起點(diǎn)的四肽異構(gòu)體①(N-Acetyl-Ser-(d)-Asp-Lys-Pro-COOH) 合成過(guò)程為例與實(shí)施例1相比，本實(shí)施例的區(qū)別點(diǎn)僅在于步驟1中未加入封閉試劑，步驟1制備 Fmoc-Pro-樹(shù)脂步驟具體為稱(chēng)取5克2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分鐘，在上述的樹(shù)脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH，25°C反應(yīng)2小時(shí)，樹(shù)脂用35ml異丙醇洗滌兩次、再用35ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗兩次，獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂；本實(shí)施例中，采用不封閉的方法合成N-ACetyl-kr-(d)Asp-Lys-Pro，其粗品純度為84. 8936%，其純品的純度為98% (HPLC歸一化法)，收率為61. 7%。粗品色譜圖見(jiàn)圖4， 純化圖和純品圖和實(shí)例1相似，故略。實(shí)施例3四肽異構(gòu)體②的合成方法以5g 二氯樹(shù)脂為起點(diǎn)的四肽異構(gòu)體②(Ν-Acetyl-Ser-Asp-d-Lys-Pro-COOH)合成過(guò)程為例1.肽樹(shù)脂的合成(1)制備 Fmoc-Pro-樹(shù)脂稱(chēng)取5克2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分鐘，在上述的樹(shù)脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH, 25°C反應(yīng)2小時(shí)，再加入封閉試劑甲醇 1. 5ml，25°C反應(yīng)2小時(shí)，樹(shù)脂用35ml異丙醇洗滌兩次、再用35ml N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF) 洗兩次，獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂；(2)制備 Fmoc-D-Lys (Boc) -OH 樹(shù)脂在步驟(1)的Fmoc-Pro-樹(shù)脂中，加入35ml脫帽試劑，25°C反應(yīng)10分鐘，用真空泵抽干，重新加入35ml脫帽試劑25 °C反應(yīng)30分鐘，抽干，用35ml異丙醇洗滌2次， 35mlDMF洗滌2次，重蒸餾的35mlDMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱 3min，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。加入用重蒸餾的DMF溶解的4. 69gFmoc-D-Lys (Boc) _0H、2mlDIEA、 3. 22gTBTU、5mlH0Bt的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF 洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性。獲得 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨；所述的脫帽試劑的組分和體積比為PIP DMF = 1 2. 5，下同；(3)制備 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂
在步驟O)的Fm0c-D-Lys(B0c)-Pr0-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟(2)；加入用重蒸餾的 DMF 溶解的 4. 12g Fmoc-Asp (otBu)-0H、2mlDIEA、3. 22gTBTU、 5mlH0Bt的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，取少量樹(shù)脂加細(xì)1茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性。獲得Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；其余操作以及工藝條件同上； (4)制備 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟(3)的Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟；加入用重蒸餾的DMF溶解的3. 84g Fmoc-Ser (tBu) -OH或 3. 84gFmoc-D-Ser (tBu) -OH,2mlDIEA,3. 22gTBTU、2mlH0Bt 的混合物，22 °C 反應(yīng) 60 分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干，取少量樹(shù)脂加茚三酮試劑，沸水中加熱 3min，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，獲得 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(5)制備 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂(肽的乙?；?在步驟的 Fmoder (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑脫帽兩次，條件同步驟；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22°C反應(yīng)60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次、DMF洗滌2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分鐘，抽干，用氮?dú)獯蹈呻臉?shù)脂成干顆粒，所得到的肽樹(shù)脂為獲得Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (B oc) -Pro-樹(shù)脂；2.肽樹(shù)脂的切割分離把吹干的Ac-Ser (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-樹(shù)脂倒入玻璃的切割瓶中， 加入預(yù)冷至_20°C的切肽試劑(TFA H2O = 95 5，體積比)80ml，20°C反應(yīng)1. 5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，加-20°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用冷乙醚洗滌1次，低溫冷凍干燥16 小時(shí)，獲得四肽異構(gòu)體粗品2. 2g ；3.對(duì)四肽異構(gòu)體粗品的分離純化(1)樣品準(zhǔn)備將四肽異構(gòu)體粗品溶于水溶液中，過(guò)濾，備用。(2)四肽異構(gòu)體粗品HPLC分析取濾液20 μ 1用HPLC分析，色譜條件CW色譜柱 (Hypersil-0DS2, Φ5· 4. 6X250mm)，流動(dòng)相:A :0. 三氟乙酸力口 99. 9%/jC ；B :0. 1%H 氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。(3)四肽異構(gòu)體粗品HPLC純化取濾液3ml 用 HPLC 純化，選用 Cw 色譜柱(Hypersil_0DS2，Φ5um 10X250mm)，流動(dòng)相A:0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脫；流速為 lOml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm ；收集目標(biāo)峰液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得四肽異構(gòu)體純品1. 6g。(4)四肽異構(gòu)體純品分析取少量樣品，配成0. 5mg/ml，過(guò)濾，取20 μ 1用HPLC分析，條件同四肽異構(gòu)體粗品 HPLC分析條件。本實(shí)施例中，異構(gòu)體②(N-AcetyHer-Asp-(d)-Lys-Pro)的收率為72. 7%，純度為98% (HPLC歸一化法)。色譜圖和實(shí)例1、2相似，故略。
實(shí)施例4四肽異構(gòu)體③的合成方法以5g二氯樹(shù)脂為起點(diǎn)的四肽異構(gòu)體③，與實(shí)施例1相比，區(qū)別僅在于本實(shí)施例僅將合成過(guò)程中Fmoc-Lys (Boc) -OH換為Fmoc-D-Lys (Boc) -0H,本實(shí)施例中，異構(gòu)體③的純度 ^ 98. 8% (HPLC歸一化法)，純品收率為79.3%。色譜圖和實(shí)例1、2相似，故略。實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體抑制BMSC分化為巨噬細(xì)胞小鼠的骨髓干細(xì)胞(BMSC)在巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MGM)中培養(yǎng)，7天后可刺激分化為巨噬細(xì)胞，在刺激過(guò)程中，加入本發(fā)明短肽，則對(duì)BMSC分化為巨噬細(xì)胞起有效的抑制作用。斷頸處死小鼠，并浸泡于75%的酒精中消毒;3min。將小鼠的股骨和脛腓骨去除， 并剝離表面組織，用1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗出的細(xì)胞液，貼壁緩慢加入ficoll 分離液上層，1800rpm離心20min。吸取云霧層，并用1640培養(yǎng)液洗滌2遍。移入6孔板， 于37°C 0)2孵箱培養(yǎng)。每天給每孔加Ac-S-D-K-P，終濃度為ΙΟηΜ，第8天常規(guī)消化細(xì)胞， 并離心收集各孔細(xì)胞，用流式細(xì)胞洗液洗滌細(xì)胞兩次，加入巨噬細(xì)胞特異性的FITC標(biāo)記的 F4/80抗體，4°C避光孵育30min。離心收集細(xì)胞，流式細(xì)胞洗液洗滌兩次，加入流式細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，細(xì)胞樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果如圖5、圖6、圖7、圖8、圖9所示，圖5 為加入陰性抗體的裸細(xì)胞對(duì)照，顯示巨噬細(xì)胞的表達(dá)率為3. 7% ；圖6為陽(yáng)性對(duì)照組，不加藥物處理，顯示巨噬細(xì)胞表達(dá)率為91. 5% ；圖7為異構(gòu)體①處理組，顯示巨噬細(xì)胞表達(dá)率為 75. 6% ；圖8為異構(gòu)體②處理組，顯示巨噬細(xì)胞表達(dá)率為74. ；圖9為異構(gòu)體③處理組， 顯示巨噬細(xì)胞表達(dá)率為68.4%。說(shuō)明本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體具有抑制BMSC分化為巨噬細(xì)胞的能力。本實(shí)驗(yàn)例中，BMSC分化成巨噬細(xì)胞后，能分泌TNF等因子，導(dǎo)致局部炎癥發(fā)生， 本發(fā)明的四肽異構(gòu)體能從源頭抑制BMSC向巨噬細(xì)胞分化，從而具有抗炎的活性。其中，異構(gòu)體①、②、③分別采用實(shí)施例1、3、4所得的四肽異構(gòu)體。實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體抑制細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞Mh。常規(guī)消化細(xì)胞，以5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度種96孔板，每孔180 μ L，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20 μ L Ac-S-D-K-P溶液，使孔內(nèi)Ac-S-D-K-P終濃度為10 μ Μ,每種Ac-S-D-K-P藥物設(shè)6個(gè)復(fù)孔。放入37°C CO2孵箱培養(yǎng)Mh，然后每孔加20 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)37°C孵育4h。吸棄各孔液體，每孔加入 100 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩混勻lOmin。用酶聯(lián)免疫標(biāo)定儀，檢測(cè)490nM的吸光度值。結(jié)果如圖10，其中1組為陽(yáng)性對(duì)照，2組為天然Ac-S-D-K-P處理組，3組為本發(fā)明四肽異構(gòu)體①處理組，4組為四肽異構(gòu)體②處理組，5組為四肽異構(gòu)體③處理組。天然Ac-S-D-K-P 處理組與陽(yáng)性對(duì)照組相比D49tl降低(P < 0. 05)；異構(gòu)體①處理組與陽(yáng)性對(duì)照組相比D49tl明顯降低(P < 0. 01)；異構(gòu)體②處理組與陽(yáng)性對(duì)照組相比D49tl明顯降低(P < 0. 01)；異構(gòu)體 ③處理組與陽(yáng)性對(duì)照組相比D49tl明顯降低(P < 0. 01)。該實(shí)驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明短肽及其異構(gòu)體均具有抑制細(xì)胞的增殖的能力，并且比天然Ac-S-D-K-P的效果更為顯著。本實(shí)驗(yàn)例中，L929是小鼠成纖維細(xì)胞，本發(fā)明的四肽異構(gòu)體能夠抑制成纖維細(xì)胞增殖，從而能夠說(shuō)明它們具有抗纖維化的活性。其中，異構(gòu)體①、②、③分別采用實(shí)施例1、3、4所得的四肽異構(gòu)體。實(shí)驗(yàn)例3穩(wěn)定性試驗(yàn)
將本發(fā)明的四肽異構(gòu)體①、異構(gòu)體②和異構(gòu)體③分別與ACE在37°C作用12h，HPLC 檢測(cè)分析，結(jié)果顯示均未被ACE降解；而天然Ac-S-D-K-P與ACE在37°C作用lOmin，HPLC 檢測(cè)分析，結(jié)果顯示天然Ac-S-D-K-P已基本完全降解。足以說(shuō)明本發(fā)明制備所得的四肽異構(gòu)體具有優(yōu)越的穩(wěn)定性，其中，尤其以異構(gòu)體③的穩(wěn)定性最佳。由上述實(shí)驗(yàn)例可知，本發(fā)明要求保護(hù)的四肽異構(gòu)體具有非常顯著的抗纖維化和抗炎效果，以本發(fā)明的四肽異構(gòu)體為活性成份的抗纖維化藥物和抗炎藥物，具有優(yōu)于天然 Ac-S-D-K-P的特性，而且在體內(nèi)抗ACE降解，半衰期大大延長(zhǎng)(> 12h)，更能夠持續(xù)有效的發(fā)揮功能。該四肽異構(gòu)體可以廣泛應(yīng)用于制備抗纖維化和抗炎藥物。
權(quán)利要求
1.一種利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的異構(gòu)體的方法，其特征在于所述的異構(gòu)體為 N-Acetyl-Ser-(d)Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp-(d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser- (d)Asp- (d) Lys-Pro，所述的方法包括以三苯氯甲基型樹(shù)脂中的任一種為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸，獲得四肽樹(shù)脂；其間依次脫去芴甲氧羰?；Ｗo(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)的四肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得四肽異構(gòu)體粗品，并經(jīng)C18或C8色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所述的四肽異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括四肽樹(shù)脂的制備(1)制備Fmoc-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂以三苯氯甲基樹(shù)脂、4-甲基-三苯氯甲基樹(shù)脂、4-甲氧基-三苯氯甲基樹(shù)脂、2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂中的一種作為起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分鐘， 其中，樹(shù)脂的重量體積濃度為5-20ml/g ；在上述的樹(shù)脂中，依次加入DIEA或DMAP、Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH，10_50°C反應(yīng)0. 5-5小時(shí)，所得樹(shù)脂分別用異丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗滌，獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Pro-樹(shù)月旨；(2)制備Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟1所得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘， 抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次，加入用重蒸餾的DMF溶解的 Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Rnoc-D-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干， 獲得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(3)制備 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) - Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟2所得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)5-30分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘， 抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入用重蒸餾的DMF溶解的 Fmoc-D-Asp (otBu) -OH 或 Fmoc-Asp (otBu) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干，獲得 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(4)制備Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂在步驟 3 所得 Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-樹(shù)月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑 10-50 °C 反應(yīng) 5-30 分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF 洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入用重蒸餾的DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10_50°C反應(yīng) 10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，抽干；(5)制備Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu)-D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨在步驟 4 所得 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂或 Fmoc-Ser (tBu) -A sp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂中，加入脫帽試劑10_50°C反應(yīng)5_30分鐘，用真空泵抽干， 重新加入脫帽試劑10-50°C反應(yīng)10-60分鐘，抽干，用異丙醇洗滌2次，DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌2次；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10_50°C反應(yīng)10-60分鐘，用真空泵抽干，用異丙醇洗滌2次、DMF洗滌2次，重蒸餾的DMF洗滌1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60 分鐘，抽干，用氮?dú)獯蹈呻臉?shù)脂成干顆粒，得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-樹(shù)月旨或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-豐對(duì)月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-樹(shù)脂；(6)制備四肽異構(gòu)體粗品將步驟5吹干后的樹(shù)脂倒入玻璃的切割瓶中，加入預(yù)冷至-20-10°C的切肽試劑，所述的切肽試劑為T(mén)FA、H20或加入EDT/Thio中的任意一種以上組成的復(fù)合液，各組分的體積比分別為90-95/2-5/2-5/1-5，10°C _50°C反應(yīng)1-5小時(shí)，過(guò)濾除去樹(shù)脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀，離心收集沉淀物，用乙醚洗滌1-6次，低溫冷凍干燥IO-M小時(shí)，獲得四肽異構(gòu)體粗品，所述切肽試劑中，樹(shù)脂的濃度為5-50ml/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟1中，DIEA或DMAP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2-20倍；Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1_10倍；反應(yīng)溶液中， 樹(shù)脂的濃度為0. l-5ml/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2-5中，所述的脫帽試劑的組分和體積比為PIP 2-5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2-4中，TBTU/HBTU/BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2-5倍；HOBt/HOAt摩爾數(shù)為樹(shù)脂取代位點(diǎn)摩爾數(shù)的2_5倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH或 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1_5倍；Fmoc-Pro-樹(shù)脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-20ml/g ；所述的步驟3中，F(xiàn)moc-D-Asp (otBu)-OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2_5倍；所述的步驟5中，乙酸酐體積為樹(shù)脂的重量的1-2倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的步驟1在反應(yīng)結(jié)束后再加入封閉試劑甲醇或苯甲酰氯吡啶10-50°C反應(yīng)0. 2-3小時(shí)，以封閉剩余的未結(jié)合位點(diǎn)，，所得樹(shù)脂分別用異丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗滌、獲得Fmoc-Pro-樹(shù)脂或Fmoc-D-Pro-樹(shù)脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的四肽異構(gòu)體粗品經(jīng)Cw或C8色譜柱分離純化的方法包括如下步驟將四肽異構(gòu)體粗品溶于水溶液中，過(guò)濾，濾液經(jīng)C18或C8色譜柱純化，流動(dòng)相有兩種 A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B :0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；線性梯度洗脫；流速為 l-150ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為215-285nm ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，分析，獲得四肽異構(gòu)體純品。
9.一種包含權(quán)利要求1所述方法所制得四肽Ac-S-D-K-P的異構(gòu)體的凍干粉針劑。
10.權(quán)利要求1所述方法所制得四肽Ac-S-D-K-P的異構(gòu)體在制備治療抗纖維化和抗炎藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用固相多肽合成四肽異構(gòu)體的方法，所述的方法包括以三苯氯甲基型樹(shù)脂的任何一種為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸，獲得四肽異構(gòu)體樹(shù)脂；其間依次脫去芴甲氧羰酰基保護(hù)基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，獲得保護(hù)的四肽異構(gòu)體樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得四肽異構(gòu)體粗品，并經(jīng)C18或C8色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得所述的四肽異構(gòu)體。本發(fā)明要求保護(hù)的四肽異構(gòu)體合成方法具有原輔材料來(lái)源方便，工藝穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，收率高，純度好，質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，可規(guī)?；a(chǎn)，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
文檔編號(hào)A61K38/07GK102558298SQ20111043667
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者張偉, 張昭, 張英起, 李萌, 楊賽, 王增祿, 黃同列 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)