專利名稱：一種表達(dá)可溶性豬γ-干擾素PoIFN-γ的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)可溶性豬Y -干擾素PoIFN- Y的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬Y-干擾素(porcine interferon gamma, PoIFN- Y )也稱豬 II 型干擾素，是一類由活化的T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤、激活淋巴細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)等功能。實(shí)際應(yīng)用中，將豬干擾素作為疫苗佐劑，與治療不同疾病的疫苗聯(lián)合使用，研制出免疫效果更好的新型疫苗，對(duì)豬病防治具有積極的影響。目前豬干擾素的批量生產(chǎn)主要有細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法和以畢赤酵母、大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的基因重組法。前一種方法以動(dòng)物細(xì)胞為原料，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，且產(chǎn)品有攜帶外源病毒和其他病原微生物的危險(xiǎn)。以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)的基因重組法雖較前一種先進(jìn)，生產(chǎn)成本大大降低，但其工藝還是相對(duì)較復(fù)雜且表達(dá)量有限。而以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的基因重組法，雖能提高其表達(dá)量，但產(chǎn)物為無(wú)活性的包涵體，需經(jīng)繁瑣低效、代價(jià)昂貴的復(fù)性過(guò)程才能獲得生物學(xué)功能。因此，如何獲得高表達(dá)量的活性豬Y-干擾素成為近年來(lái)學(xué)者們廣為研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)制備豬Y-干擾素表達(dá)量低、產(chǎn)物為無(wú)活性包涵體、制備工藝復(fù)雜繁瑣等缺陷，提出了一種表達(dá)可溶性豬Y-干擾素的基因工程菌及其構(gòu)建方法，以及利用該基因工程菌進(jìn)行豬Y-干擾素的高效制備方法；通過(guò)采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵表達(dá)豬Y-干擾素，省去了監(jiān)測(cè)菌體密度和添加IPTG誘導(dǎo)劑等步驟，使操作簡(jiǎn)潔易行，同時(shí)避免了 IPTG對(duì)菌體的毒害作用。利用本發(fā)明方法制備豬Y-干擾素，成本低、易操作、產(chǎn)量高且活性好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種表達(dá)可溶性豬Y-干擾素PoIFN-Y的基因工程菌，所述基因工程菌是同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和質(zhì)粒pTf 16-PaMB_tig的大腸桿菌BL21(DE3) ο其中，所述重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-Y中的PoIFNi基因序列是SEQ IDN0.4 ;所述質(zhì)粒pTfl6-PaMB-tig可表達(dá)分子伴侶tig。其中，所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)的5'端為SEQ ID N0.2 (含腸激酶和KpnI酶切位點(diǎn))，3'端為SEQ ID N0.3 (含終止密碼子和BamHI酶切位點(diǎn))，中間為經(jīng)優(yōu)化的豬Y-干擾素成熟肽基因(SEQ ID N0.1)。本發(fā)明還提出了所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其步驟為:將所述重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN- Y和質(zhì)粒pTf 16-PaMB_tig分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到所述
基因工程菌。 其中，所述重組質(zhì)粒pET_32a(+)-PoIFN-Y的構(gòu)建方法為:首先人工合成所述PoIFN-y 基因(SEQ ID N0.4)，用 KpnI/BamHI 對(duì)所述 PoIFN-γ 基因(SEQ ID N0.4)和質(zhì)粒pET_32a(+)進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，再挑取重組子并提取得到所述重組質(zhì)粒pET-32a (+) -PoIFN- Y。所述重組質(zhì)粒pET_32a (+) -PoIFN- Y經(jīng)測(cè)序鑒定，證實(shí)其含有所述 PoIFN-Y 基因(SEQ ID N0.4)。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述基因工程菌制備可溶性豬Y-干擾素PoIFN-Y的方法，其步驟為:將所述表達(dá)可溶性豬Y-干擾素的基因工程菌于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后離心收集菌體；重懸所述菌體，攪拌過(guò)夜后，將其超聲破碎并離心收集上清，經(jīng)鎳離子親和層析并脫鹽、濃縮得到純化的豬Y -干擾素融合蛋白，將其酶解后再次經(jīng)鎳離子親和層析并脫鹽、濃縮，得到所述豬Y-干擾素。其中，所述自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:甘油0.1-2% v/v、胰蛋白胨0.1-2% w/v,酵母提取物 0.1-2 % w/v,乳糖 0.1-2 % w/v,葡萄糖 0.01-0.2 % w/v, NaCl0.1-2 % w/v,Na2HP045-100mM, KH2P045-100mM, (NH4) 2S045-100mM, MgS04l_20mM。其中，所述菌體的重懸使用破菌緩沖液，其配方為:Trisl0-100mM、溶菌酶0.01-0.2% w/v、TritonX-1000.1-1 % v/v。本發(fā)明還提供了一種用于治療豬病毒性疾病的組合物，其含有有效量的可溶性豬
Y-干擾素，以及藥學(xué)可接受成分。本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種表達(dá)可溶性豬Y -干擾素的基因工程菌，用于生產(chǎn)可溶性且成本低的豬Y-干擾素。本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是構(gòu)建一種可溶性表達(dá)豬Y-干擾素的基因工程菌。其特征在于，該基因工程菌是同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和質(zhì)粒pTfl6-ParaB-tig 的大腸桿菌 BL21 (DE3)。所述的基因工程 菌的進(jìn)一步特征在于，所述的重組質(zhì)粒是pET_32a(+)-PoIFN- Y，能夠高效表達(dá)豬Y-干擾素，其中，PoIFN-Y基因具有如下本發(fā)明設(shè)計(jì)的SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列:
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)可溶性豬Y-干擾素PoIFN-Y的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和質(zhì)粒pTf 16-PaMB_tig的大腸桿菌BL21(DE3)。
2.如權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-Y中的PoIFN- Y基因序列是SEQ ID N0.4 ;所述質(zhì)粒pTf 16_ParaB_tig可表達(dá)分子伴侶tig。
3.如權(quán)利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述PoIFN-Y基因(SEQID N0.4)的5'端為SEQ ID N0.2，3'端為SEQ ID N0.3，中間為豬Y-干擾素成熟肽基因(SEQ IDN0.1)。
4.如權(quán)利要求1或2所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，其步驟為:將所述重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN- Y和質(zhì)粒pTf 16-PaMB_tig分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到如權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌。
5.如權(quán)利要求4所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pET-32a(+) -PoIFN-y的構(gòu)建方法為:首先人工合成所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)，用KpnI/BamHI對(duì)所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)和質(zhì)粒pET_32a(+)進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，再挑取重組子并提取所述重組質(zhì)粒pET_32a (+) -PoIFN- Y。
6.如權(quán)利要求5所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pET-32a(+) -PoIFN-y經(jīng)測(cè)序鑒定，證實(shí)其含有所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)。
7.應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述基因工程菌制備可溶性豬Y-干擾素PoIFN-Y的方法，其特征在于，其步驟為:將所述表達(dá)可溶性豬Y-干擾素PoIFN-Y的基因工程菌于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后離心收集菌體；重懸所述菌體，攪拌過(guò)夜后，將其超聲破碎 并離心收集上清，經(jīng)鎳離子親和層析并脫鹽、濃縮得到純化的豬Y-干擾素融合蛋白，將其酶解后再次經(jīng)鎳離子親和層析并脫鹽、濃縮，得到所述豬Y -干擾素 PoIFN- Y。
8.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述自兩導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:甘油0.1-2% V/V、胰蛋白胨0.1-2% w/v,酵母提取物0.1-2 % w/v,乳糖0.1-2% w/v,葡萄糖0.01-0.2%w/v, NaCl0.1-2% w/v, Na2HP045-100mM, KH2P045-100mM, (NH4) 2S045-100mM, MgS04l_20mM。
9.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述菌體的重懸使用破菌緩沖液，其配方為:TrislO-lOOmM、溶菌酶 0.01-0.2% w/v、TritonX-1OO0.1-1% v/v。
10.一種用于治療豬病毒性疾病的組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的按權(quán)利要求7所制備的可溶性豬Y -干擾素PoIFN- Y，以及藥學(xué)可接受成分。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種表達(dá)可溶性豬γ-干擾素PoIFN-γ的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的表達(dá)可溶性豬γ-干擾素PoIFN-γ的基因工程菌是同時(shí)攜帶重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和質(zhì)粒pTf16-ParaB-tig的大腸桿菌BL21(DE3)。其中，所述重組質(zhì)粒pET-32a(+)-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ ID NO.4；所述質(zhì)粒pTf16-ParaB-tig可表達(dá)分子伴侶tig。本發(fā)明方法提高了豬γ-干擾素的可溶性及產(chǎn)量，工藝簡(jiǎn)單且成本低，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P31/12GK103146631SQ20131008377
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者龍譚, 汪正華, 吳自榮, 郗洪生, 王濱坤 申請(qǐng)人:江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司