專利名稱：一種鴨病毒性肝炎自殺性dna疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(DHV)弓丨起的雛鴨的一種高度致死、快速傳播的病毒性傳染病。該病的特征是發(fā)病急、病程短、死亡率高。臨床癥狀以痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀為主要特征，病理變化主要以肝臟腫大和斑點(diǎn)出血為特征性病變。DHV分為三個(gè)血清型，即I型、II型和III型，三個(gè)血清型之間無(wú)交叉保護(hù)作用。I型DHV呈世界性分布，并常和其它病毒、細(xì)菌混合感染，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的危害很嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也是對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)威脅最大的一種傳染病。DHV-I 結(jié)構(gòu)蛋白為VP0、VP3、VP1構(gòu)型，其中，結(jié)構(gòu)蛋白中VPl位于衣殼表面，含有主要的抗原決定簇,包含了大多數(shù)能夠與細(xì)胞受體相互作用的抗原表位,能夠誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生中和抗體, 所以認(rèn)為VPl與DHV的致病性有密切的關(guān)系。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，殼體蛋白含有多個(gè)β片層結(jié)構(gòu)， 與其相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)位于殼粒表面，這在免疫學(xué)中占有重要作用?，F(xiàn)有的DVH疫苗有DVH雞胚化弱毒苗、DVH雞胚化滅活苗和DVH鴨胚化滅活苗3 種。通常認(rèn)為弱毒苗的免疫效果要好于滅活苗，但是存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。與弱毒苗相比， 滅活苗雖然安全，但是往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗。Berglund等于1998年率先提出了以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的自殺性DNA疫苗 (suicidal DNA vaccine)的設(shè)想，即利用自殺性DNA疫苗的甲病毒進(jìn)入細(xì)胞后能表達(dá)出甲病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下，甲病毒基因組RNA進(jìn)行高效復(fù)制，在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，基于甲病毒復(fù)制子的DNA 疫苗可引起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，也稱自殺性DNA疫苗，它比傳統(tǒng)DNA疫苗更安全，無(wú)整合到宿主染色體的潛在危險(xiǎn)性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效復(fù)制同時(shí)，目的抗原在亞基因組啟動(dòng)子的調(diào)控下獲得高效表達(dá)，從而可以較低的免疫劑量引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的復(fù)制型DNA載體。病毒復(fù)制時(shí)結(jié)構(gòu)基因拷貝數(shù)高達(dá)IO5之多，因此可以利用亞基因組的啟動(dòng)子使外源基因獲得高效表達(dá)。 自殺性DNA疫苗由于其具有RNA復(fù)制子，大量復(fù)制可導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡。該凋亡可能是復(fù)制型載體在表達(dá)外源基因的過(guò)程中產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)制中間體介入的結(jié)果。dsRNA 能在細(xì)胞和體液免疫中起強(qiáng)大的輔助作用。后來(lái)，研究者將RNA復(fù)制子載體系統(tǒng)改造成以 DNA為基礎(chǔ)的、RNA聚合酶η依賴的系統(tǒng)。這種載體攜帶了甲病毒復(fù)制酶基因和外源基因的重組質(zhì)粒DNA，缺失了病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。它通過(guò)將人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列插入到SP6啟動(dòng)子的上游或替換SP6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，在多克隆位點(diǎn)下游插入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SV40晚期聚A信號(hào)序列，正常終止轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，利用宿主RNA聚合酶η在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，合成甲病毒復(fù)制酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達(dá)效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構(gòu)建上我們可以看出其具有RNA 疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，能自主復(fù)制、大量表達(dá)。甲病毒復(fù)制子載體表達(dá)效率高，在理論上，在4h內(nèi)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生20萬(wàn)個(gè)RNA 拷貝，表達(dá)的外源蛋白可占細(xì)胞總蛋白的25%。甲病毒復(fù)制酶可在多種細(xì)胞中發(fā)揮作用，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等。RNA的復(fù)制在細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行，是與宿主的復(fù)制系統(tǒng)分開的。甲病毒復(fù)制子載體的高表達(dá)效率、廣泛的宿主細(xì)胞類型和獨(dú)立的細(xì)胞漿復(fù)制系統(tǒng)等特性，很適合作為DNA疫苗。該類載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，其RNA復(fù)制酶可合成大量的雙鏈RNA (dsRNA)，而dsRNA可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡，，因此稱為自殺性DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，以解決現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有的DVH疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗的技術(shù)性問(wèn)題。本發(fā)明的第二目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒復(fù)制子載體 PSCAl組成，所述DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第2106至 2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列g(shù)gtgattccaaccagttgggggatgatgagccagtttgctttctaaattttgagacagct60
aatgtcccaatacaaggtgaatctcacactcttgttaaacacctgtttgggaggcaatgg120
ttagttaagactgtgcaacacgcttcaactgtgcaagagttggacctccaagttccagac180
agaggacatgcctctctcattcagttctttgtctatttttctggagagatcattctcact240
attgttaacaatggcactacaccagcaatggtagcacactcctattctatggatgacctc300
agttcagagtatgctgttacagcaatgggaggtgtgatgattcctgctaacagtgccaaa360
aatatttctgtaccattctactctgtaacaccactcaggccaactcgaccaattcctggc420
acatcagaggcaacttttggcagactgttcatgtggactcaatcaggaagtctttcagtt480
tttatgggtctcaaaaagccagctctcttctttccactccctgctcccacctccacaata540
ctaccacagaaatccaaagatgttattcccacattgaatcagtctggggatgaagtagat600
tgtcacttctgcgaaatttgctctaaaatgaagaggaggtggaagccaagagggtacttc660
agattttgcc ttaggct丨caa aacactagca tctgaactca atctggaaatt gaa
714。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法，包括如下步驟I) DHV病毒總RNA的提取及純化將DHV ZJ08病毒株腿部肌注射兩日齡的小鴨， 待小鴨死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規(guī)方法提取DHV病毒總RNA ；2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，在上游引物中引入Kozak序列VPl-F :5’ -CGGGATCC Banffl TGCCACCATG,^GGTGATTCCAACCAGTT-3，,
VPl-R :5’ -TCCCCCGGG,^ tTTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA~3’ ；3)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到DHV-VPl的全長(zhǎng)cDNA基因序列；4)將步驟3)擴(kuò)增的VPl片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPl cDNA片段； 5)將VPl全長(zhǎng)cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCAl真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗——抗DHV的pSCAl-VPlDHV疫苗。進(jìn)一步地,步驟3)進(jìn)一步包括在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，于I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備預(yù)防鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備治療鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)I、所需的免疫劑量??；2、與現(xiàn)有的弱毒苗和滅活苗相比，本發(fā)明的自殺性DNA疫苗更加安全、高效；3、本發(fā)明的自殺性DNA疫苗在動(dòng)物體內(nèi)一過(guò)性表達(dá)外源基因后，隨細(xì)胞凋亡而被機(jī)體清除，從而可避免DNA質(zhì)?？赡苷系剿拗骷?xì)胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患；4、本發(fā)明的自殺性DNA疫苗更長(zhǎng)效，穩(wěn)定，且操作便捷。


圖I為用RT-PCR方法擴(kuò)增VPl基因的電泳檢測(cè)圖；圖2為pSCAl-VPl重組質(zhì)粒酶切鑒定的電泳檢測(cè)圖；圖3為VPl基因在細(xì)胞中表達(dá)RT-PCR的電泳檢測(cè)圖；圖4為VPl蛋白在細(xì)胞中表達(dá)后在熒光顯微鏡下的結(jié)構(gòu)圖，其中，a為重組質(zhì)粒 pSCAl-VPl轉(zhuǎn)染400 X ；b為重組質(zhì)粒pSCAl_VPl轉(zhuǎn)染100X ；c陰性對(duì)照；圖5為構(gòu)建本發(fā)明的自殺性DNA疫苗PSCA1/VP1的策略示意圖；圖6為本發(fā)明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗刺激雛鴨T淋巴細(xì)胞增殖后，試驗(yàn)組與對(duì)照組于λ 570nm處測(cè)定OD值的對(duì)比圖；圖7為本發(fā)明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗刺激雛鴨產(chǎn)生特異性抗體后，試驗(yàn)組與對(duì)照組于λ 450nm處測(cè)定每孔的OD值的對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。本發(fā)明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒復(fù)制子載體pSCAl組成，如圖5，DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第 2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列g(shù)gtgattcca accagttggg ggatgatgag ccagtttgct ttctaaattt tgagacagct 60aatgtcccaa tacaaggtga atctcacact cttgttaaac acctgtttgg gaggcaatgg 120
ttagttaagactgtgcaacacgcttcaactgtgcaagagttggacctccaagttccagac180
agaggacatgcctctctcattcagttctttgtctatttttctggagagatcattctcact240
attgttaacaatggcactacaccagcaatggtagcacactcctattctatggatgacctc300
agttcagagtatgctgttacagcaatgggaggtgtgatgattcctgctaacagtgccaaa360
aatatttctgtaccattctactctgtaacaccactcaggccaactcgaccaattcctggc420
acatcagaggcaacttttggcagactgttcatgtggactcaatcaggaagtctttcagtt480
tttatgggtctcaaaaagccagctctcttctttccactccctgctcccacctccacaata540
ctaccacagaaatccaaagatgttattcccacattgaatcagtctggggatgaagtagat600
tgtcacttctgcgaaatttgctctaaaatgaagaggaggtggaagccaagagggtacttc660
agattttgccttaggctcaa aacactagca tctgaactca atctggaaat tgaa714
實(shí)施例I :本發(fā)明的鴨病毒性肝炎自殺性DNV疫苗-PSCAI-VPI自殺性DHV疫苗的
構(gòu)建方法，包括如下步驟I)DHV病毒總RNA的提取及純化^fDHV ZJ08病毒株腿部肌肉注射兩日齡的小鴨， 待小鴨死亡后，解剖取其肝臟，用剪刀將肝臟剪碎研磨，并加入I %的雙抗，將研磨液反復(fù)凍融3次后,用TakaRa Catrimox-14 試劑盒提取RNA,具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，在上游引物中引入Kozak序列VPl-F :5’ -CGGGATCC一 ,GCCACCATG,...,糾GGTGATTCCAACCAGTT-3，,VPl-R :5’ -TCCCCCGGG,^ JTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3 。3)提取RNA后，再用Takara M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,具體步驟如下將 9 μ L提取的RNA和I μ L VPl-R引物均勻混合，70°C水浴IOmin后，冰上極冷2min，最后離心數(shù)秒。配制反轉(zhuǎn)錄緩沖液，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒。反應(yīng)體系M-MLV Buffer 2μ 、ΚΝΑ/引物變性溶液 6yL、dNTP Mixture (2. 5mM) 2 μ L、RNase Inhibitor O. 25 μ L>RTase M-MLVO. 5 μ L、 加滅菌蒸餾水至20 μ L。42°C溫浴Ih后，70°C水浴15min，最后在冰上2min，得到的cDNA 于-20°C保存?zhèn)溆谩?)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到DHV-VPl的全長(zhǎng)cDNA基因序列； 在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，54°C退火lmin， 72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，于I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，請(qǐng)參閱圖1，為VPl基因擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)圖。5)將步驟4)擴(kuò)增的VPI片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收 VPIcDNA片段，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。6)將步驟5)回收的VPl全長(zhǎng)cDNA片段和pSCAl空載體用BamHI和SmaI進(jìn)行雙酶切，并利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPl cDNA和pSCAl空載體片段，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。7)將回收的VPIcDNA和pSCAl空載體片段用solution I進(jìn)行連接，連接體系如
下
權(quán)利要求
1.一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，其特征在于，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒復(fù)制子載體PSCAl組成，所述DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列g(shù)gtgattccaaccagttgggggatgatgagccagtttgctttctaaattttgagacagct60aatgtcccaatacaaggtgaatctcacactcttgttaaacacctgtttgggaggcaatgg120ttagttaagactgtgcaacacgcttcaactgtgcaagagttggacctccaagttccagac180agaggacatgcctctctcattcagttctttgtctatttttctggagagatcattctcact240attgttaacaatggcactacaccagcaatggtagcacactcctattctatggatgacctc300agttcagagtatgctgttacagcaatgggaggtgtgatgattcctgctaacagtgccaaa360aatatttctgtaccattctactctgtaacaccactcaggccaactcgaccaattcctggc420acatcagaggcaacttttggcagactgttcatgtggactcaatcaggaagtctttcagtt480tttatgggtctcaaaaagccagctctcttctttccactccctgctcccacctccacaata540ctaccacagaaatccaaagatgttattcccacattgaatcagtctggggatgaagtagat600tgtcacttctgcgaaatttgctctaaaatgaagaggaggtggaagccaagagggtacttc660agattttgccttaggctcaaaacactagcatctgaactcaatctggaaattgaa714。
2.一種如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟1)DHV病毒總RNA的提取及純化將DHV ZJ08病毒株腿部肌注射兩日齡的小鴨，待小鴨死亡后，取其肝臟制備研磨液，按常規(guī)方法提取DHV病毒總RNA ；2)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，在上游引物中引入Kozak序列VPl-F :5’ -CGGGATCC BamH IGCCACCATG,GGTGATTCCAACCAGTT-3，,VPl-R :5’ -TCCCCCGGG Sma JTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3 ；3)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆得到DHV-VPl的全長(zhǎng)cDNA基因序列；4)將步驟3)擴(kuò)增的VPl片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPlcDNA 片段；5)將VPl全長(zhǎng)cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCAl真核表達(dá)載體中，構(gòu)建成鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗——抗DHV的pSCAl-VPl DHV疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3)進(jìn)一步包括在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，54°C退火 lmin，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin后，10°C終止反應(yīng)，于I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。
4.一種如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備預(yù)防鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
5.一種如權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備治療鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒復(fù)制子載體pSCA1組成，該DNA疫苗的構(gòu)建包括如下步驟DHV病毒總RNA的提取及純化，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，克隆得到DHV-VP1的全長(zhǎng)cDNA基因序列，最后將純化后的VP1全長(zhǎng)cDNA片段重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA1真核表達(dá)質(zhì)粒中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的疫苗所需的免疫劑量小，安全，高效；可隨細(xì)胞凋亡而被機(jī)體清除，從而可避免DNA質(zhì)?？赡苷系剿拗骷?xì)胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，且更長(zhǎng)效，穩(wěn)定，操作便捷。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102580116SQ20111043378
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者劉光清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所