專利名稱：精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種用于治療乙型肝炎病毒感染的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子制造方法。
乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染包括慢性乙型HBV攜帶，這一疾病已經(jīng)嚴(yán)重地威脅著人類的健康。機(jī)體感染了HBV之后，由于種種原因不能有效地清除HBV，呈現(xiàn)對HBV的免疫功能不足，或伴有出現(xiàn)“抗HBs-抗獨(dú)特型抗體”(抗HBs-抗Id)這種自身免疫反應(yīng)，造成對HBV的免疫紊亂。機(jī)體對HBV的免疫功能障礙，導(dǎo)致成為HBV慢性感染。目前，國內(nèi)外對HBV均缺乏特效抗病毒藥，因而免疫調(diào)節(jié)治療就顯得非常重要。
發(fā)明者曾研制了一種稱為乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子(簡稱HSTF)，幫助對HBV免疫功能障礙的機(jī)體建立正常的免疫功能，以消滅病人體內(nèi)的HBV。經(jīng)初步臨床觀察，顯示HSTF是治療慢性乙型肝炎難得的一種好藥，對重建機(jī)體關(guān)于HBV的正常免疫狀態(tài)，可以起著獨(dú)特的重要作用。
本發(fā)明的目的是為了生產(chǎn)純度的HSTF，名稱為乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子精制品或稱精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子，以擴(kuò)大HSTF在治療HBV感染時的臨床適應(yīng)癥和提高HSTF的療效。
本發(fā)明基于申請?zhí)枮?2111441.9的“乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)方法”內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)，實驗表明，HSTF特異活性組分能與乙型肝炎病素表面抗原即HBSAg或HBs-抗Id特異結(jié)合，根據(jù)這種特性，本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先取用血漿呈乙肝病素表面抗體(抗-HBs)陽性者的人體血液，該血液其它指標(biāo)達(dá)到正常衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，分離出白細(xì)胞，按常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)移因子，這種制品簡稱為HSTF，采用乙肝疫苗也即HBsAg或抗HBs-抗Id與HSTF相結(jié)合，再通過磷酸鹽緩沖液稀釋，通過透析、超濾、分離純化出HSTF的特異活性組分，再經(jīng)生理鹽水洗滌，濃縮、除菌。得精制的乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
本發(fā)明制品與HSTF的區(qū)別在于本發(fā)明制品不能做為一般轉(zhuǎn)移因子使用，僅含有對HBV特異的免疫活性組分，即僅能用于HBV感染的治療，初步的臨床應(yīng)用表明，HSTF的療治其HBsAg陰轉(zhuǎn)率等高于美國某一藥廠生產(chǎn)的干擾能(γFN 2b)用于治療慢性乙肝的效果，本發(fā)明制品將對幫助HBV慢性感染者建立正常免疫狀態(tài)起著更有效的作用。
本發(fā)明中乙肝疫苗一般首先經(jīng)生理鹽水稀釋、透析洗滌；或經(jīng)洗滌后再與白蛋白混合，例如人血白蛋白、牛血清白蛋白，再置冰浴中緩慢滴加戊二醛，攪拌至膠凍形成，研碎，離心棄上清，得經(jīng)處理后的乙肝疫苗(吸附劑)，再將上述洗滌過的或還經(jīng)進(jìn)一步處理過的乙肝疫苗(吸附劑)與HSTF混合。
抗HBs-抗Id的制備可以用常規(guī)方法得到以外，本發(fā)明還優(yōu)選如下方法先由乙肝疫苗免疫一種哺乳動物，使其血漿含高滴度抗-HBs后，取該動物血，提取高效價抗-HBs，以該高效價抗-HBs為抗原免疫另一種哺乳動物，當(dāng)獲高滴度抗HBs-抗Id后，取這種動物血，提取高效價的抗HBs-抗Id，并經(jīng)DEAE一纖維純化，最后得抗HBs-抗Id(吸附劑)。
抗HBs-抗Id在HSTF混合以前一般也首先經(jīng)生理鹽水稀釋、透析洗滌后再混合，或在洗滌后置冰浴中緩慢滴加戊二醛，撐拌無膠凍形成，研碎、離心棄上清，得處理后的抗HBs-抗Id(吸附劑)再與HSTF混合；在滴加戊二醛以前還可先與白蛋白混合，再滴戊二醛。
上述混合中使用的試劑，可以是磷酸鹽一氯化納緩沖液，也可以是生理鹽水等，乙肝疫苗或抗HBs-抗Id與HSTF相混合時，在0～4℃之間攪拌使其吸附，再透析或離心洗滌，至透析液或離心廢棄液A280nm＜0.015，取透析余留物或離心沉淀物，再通過磷酸鹽緩沖液稀釋，攪拌溫度是15℃～25℃，再超濾或透析，濃縮，除菌過濾，分裝，凍干，即得到本發(fā)明精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
實施例1a.緩沖液的配制。配制PH7.0磷酸鹽-氯化鈉緩沖液(簡稱PBS)KH2PO412.25g，NaOH2.05g，NaCl 17.55g，加水至100ml。按比例配制，高壓滅菌后貯存，用時稀釋一倍。配制PH7.0磷酸鹽緩沖液(簡稱PB)同PBS配制，僅不含NaCl。
b.洗滌乙肝疫苗將乙肝疫苗HBsAg，(選用基因工程疫苗為佳)，用生理鹽水稀釋，透析，重復(fù)多次，透析袋內(nèi)置留物即洗滌過的乙肝疫苗。
c.以HBsAg吸附乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的特異活性組分以一定量的PBS稀釋洗滌過的乙肝疫苗，再加上一定比例的HSTF，用電磁攪拌器在冰浴中攪拌2小時，4℃放置過夜，再在0～4℃用PBS稀釋透析三至五次；至透析液A280nm＜0.015，以除去未能與HBsAg特異結(jié)合的轉(zhuǎn)移因子組分。
d.分離純化乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的特異活性組分用PB稀釋透析袋內(nèi)置留物，室溫(20℃)攪拌30分鐘，再超濾或透析，收集透析液，重復(fù)數(shù)次(至最后A280nm＜0.015透析液棄去為止)，將透析液收集超液除去PB，因生理鹽水洗滌，除菌過濾，分裝、凍干，即得本發(fā)明的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
實施例2a.配制PBS與PBb.乙肝疫苗免疫吸附劑的制備乙肝疫苗先經(jīng)生理鹽水洗滌，取一定量PBS稀釋的乙肝疫苗與牛血清白蛋白(BSA)，BSA在反應(yīng)體系中的終濃度為50mg/ml，置冰浴中邊攪拌邊緩慢滴加5%戊二醛，戊二醛的終濃度為1.6%。戊二醛滴加完畢后再繼續(xù)攪拌至膠凍完全形成。將膠凍懸浮于少量PBS中，用勻漿器研碎后，離心棄上清，重復(fù)勻漿，離心洗滌，直至上清液在A280nm＜0.015為止。
c.免疫吸附乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子特異活性組分將以PBS稀釋的乙肝疫苗(吸附劑)與一定量HSTF混合，用電磁攪拌器在冰浴中攪拌2小時，4℃放置過夜，再在0～4℃用PBS離心洗滌免疫吸附物三至五次，至A280nm＜0.015，以除去未與HBsAg結(jié)合的轉(zhuǎn)移因子組分。
d.分離純化乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子特異活性組分在上述的離心沉淀物中加入一定量的PB，室溫(20℃)左右，攪拌30分鐘，離心，將上清液收集，透析、超濾、濃縮、陳菌過濾、分裝、凍干，即得所發(fā)明的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
實施例3a.配制PBS與PBb.制備抗HBs-抗Id以乙肝疫苗(基因工程疫苗)免疫一種哺乳動物(例如4月齡豬)，每次皮下注射乙肝疫苗20ug左右，每月一次，共免疫5次左右，使血漿含高滴度抗-HBs后，取動物血，并提取高效價抗HBs；以高效價抗-HBs為抗原，以類似方法免疫另一種哺乳動物(例如家兔)，當(dāng)這種動物獲高滴度抗HBs-抗Id后，取這種動物血，并提取高效價的抗HBs-抗Id，并經(jīng)DEAE-纖維素純化。
c.以抗HBs-抗Id為免疫吸附劑，參照上述實施例1法中的C、d步驟即可得所發(fā)明的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
實施例4a.配制PBS與PBb.制備抗HBs-抗Idc.以抗HBs-抗Id為免疫吸附劑，參照實施例2法中的b.c.d步驟，即可得所發(fā)明的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子。
權(quán)利要求
1.一種精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，取用血漿乙肝病毒表面抗體(抗-HBS)陽性者的人體血液，該血液其它指標(biāo)達(dá)到正常衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，分離出白細(xì)胞，按常規(guī)方法提取得到轉(zhuǎn)移因子(簡稱為HSTF)，其特征在于采用乙肝疫苗(HBSAg)或抗HBS-抗Id與HSTF相結(jié)合，再通過磷酸鹽緩沖液稀釋，通過透析、超濾，分離純化出HSTF的特異活性組分，再經(jīng)生理鹽水洗滌、濃縮、除菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，其特征在于乙肝疫苗首先經(jīng)生理鹽水稀釋、透析洗滌；或經(jīng)洗滌后與白蛋白混合，置冰浴中緩慢滴加戊二醛，攪拌至膠凍形成，研碎、離心棄上清，得經(jīng)處理后的乙肝疫苗(吸附劑)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，其特征在于用磷酸鹽一氯化鈉緩沖液(簡稱PBS)稀釋乙肝疫苗或抗HBs-抗Id并與HSTF相結(jié)合，在0～4℃之間攪拌，促使其吸附，再透析或離心洗滌，至透析液或離心廢棄液A280nm＜0.015，透析余留物或離心沉淀物再通過磷酸鹽緩沖稀釋分離，攪拌溫度是15℃～25℃。
4.按照權(quán)利要求1所述的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，其特征在于抗HBs-抗Id的制備是先由乙肝疫苗免疫一種哺乳動物，使血漿含高滴度抗-HBs后，取該動物血，提取高效價抗-HBs，以高效價抗-HBS為抗原免疫另一種哺乳動物，當(dāng)獲高滴度抗HBs-抗Id后，取這種動物血，提取高效價的抗HBs-抗Id，并經(jīng)DEAE-纖維純化，得抗HBs-抗Id。(吸附劑)。
5.按照權(quán)利要求1或4所述的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，其特征在于抗HBs-抗Id首先經(jīng)生理鹽水稀釋透析洗滌，或在洗滌后置冰浴中緩慢滴加戊二醛，攪拌至膠凍形成，研碎，離心棄上清，得經(jīng)處理后的抗HBs-抗Id(吸附劑)
6.按照權(quán)利要求5所述的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，其特征在于抗HBs-抗Id洗滌后滴加戊二醛以前與白蛋白混合。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種用于治療乙型肝炎病素(HBV)感染的精制乙型肝炎高度特異轉(zhuǎn)移因子的制造方法，取用血漿乙肝病素表面抗體(抗-HBs)陽性者的人體血液，該血液其它指標(biāo)達(dá)到了正常衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，分離出白細(xì)胞，按常規(guī)方法提取得到轉(zhuǎn)移因子(簡稱HSTF)，采用乙肝疫苗(HBsAg)或抗HBs-抗Id與HSTF相結(jié)合，再通過磷酸鹽緩沖液稀釋，通過透析、超濾、分離純化出HSTF的特異活性組分，再經(jīng)生理鹽水洗滌，濃縮、除菌，得本發(fā)明制品，本發(fā)明對幫助HBV慢性感染者建立正常免疫狀態(tài)起著更有效的作用。
文檔編號A61K39/395GK1110926SQ9410510
公開日1995年11月1日 申請日期1994年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月30日
發(fā)明者林寶秋, 董慶嘉 申請人:林寶秋, 董慶嘉