專利名稱：一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液及其生產(chǎn)工藝，具體地說(shuō)是用硫酸銨濃度梯度法生產(chǎn)鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液。
背景技術(shù)：
鹽酸柔紅霉素是臨床上常用的蒽環(huán)類廣譜的抗腫瘤藥物。目前主要應(yīng)用于急慢性白血病，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，以及一些實(shí)體腫瘤，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤，腎母細(xì)胞瘤和Ewing肉瘤等。但是如同其他抗腫瘤化療藥物一樣，鹽酸柔紅霉素在使用過(guò)程中對(duì)患者產(chǎn)生較大的毒副作用，主要限制劑量的毒副作用有骨膸抑制和心臟毒性，此外還有胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)，藥量蓄積產(chǎn)生的對(duì)鹽酸柔紅霉素的耐藥等。這些毒副作用極大地限制了鹽酸柔紅霉素的臨床應(yīng)用。而應(yīng)用脂質(zhì)體包裹鹽酸柔紅霉素則不失為一種非常理想的降低毒性的方法。
脂質(zhì)體為磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，主要成分是磷脂和膽固醇，對(duì)人體無(wú)毒性、無(wú)免疫原性。由于其粒徑大小、表面易被控制，容量大，具膜特性和生物兼容性等特點(diǎn)，近年來(lái)被用于一些抗腫瘤藥物的包裹。當(dāng)藥物被投放到病灶部位后，藥物從脂質(zhì)體中緩慢釋放出來(lái)，達(dá)到降低毒性提高療效的目的。但是由于脂質(zhì)體的組分容易與血漿蛋白(調(diào)理素)結(jié)合，隨后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，使其很快在血循環(huán)中被清除。藥物穩(wěn)定性及包封率較低，漏出率較高，脂質(zhì)體的體循環(huán)時(shí)間較短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種毒性小、包封率高、穩(wěn)定性好的鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液的生產(chǎn)工藝。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液，它由脂質(zhì)體膜和包埋在其中水相的鹽酸柔紅霉素組成，鹽酸柔紅霉素和脂質(zhì)體膜的藥/脂比例(w/w)最高為0.2∶1。
所述脂質(zhì)體膜中含有大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)。我們對(duì)脂質(zhì)體膜的成分進(jìn)行了改造，加入大分子的多聚乙烯-乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSE-PEG2000)，這種新型脂質(zhì)體可非常有效地躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，穩(wěn)定性及包封率得到提高，漏出率降低，使新型脂質(zhì)體的體循環(huán)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。此種脂質(zhì)體在病灶組織中的濃度也顯著提高，而在心臟骨髓等臟器的濃度降低，達(dá)到降低毒性的作用。
所述脂質(zhì)體膜基本上由注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)組成。
一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液的生產(chǎn)工藝，它包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體配制注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇及多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入硫酸銨溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的硫酸銨溶液經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成均勻的小單層脂質(zhì)體液，除去脂質(zhì)體外的硫酸銨；(3)制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將注射用鹽酸柔紅霉素溶入濃度為5～15％蔗糖液中，在65℃條件下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入到小單層脂質(zhì)體液中，水浴15～60分鐘，使鹽酸柔紅霉素進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去蔗糖和游離的鹽酸柔紅霉素得到成品。
所述步驟(1)中注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為1.5～2.5∶0.5～1.5∶0.06～0.2。
所述步驟(1)中硫酸銨溶液的濃度為125～250mM，pH值為5～6。
所述的pH值優(yōu)選5.5。
所述步驟(2)中除去脂質(zhì)體外的硫酸銨是指用濃度為5～15％蔗糖pH 5～6平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
所述的pH值優(yōu)選5.5。
所述步驟(3)中的蔗糖液的濃度優(yōu)選為10％。
所述步驟(3)中除去蔗糖是指用經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明提供的新型脂質(zhì)體可非常有效地躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，穩(wěn)定性及包封率得到提高，漏出率降低，使新型脂質(zhì)體的體循環(huán)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。此種脂質(zhì)體在病灶組織中的濃度也顯著提高，而在心臟骨髓等臟器的濃度降低，達(dá)到降低毒性的作用。
使用本發(fā)明提供的方法制得的鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體包封率高(95％以上)，滲漏率低，脂質(zhì)體粒徑均勻，穩(wěn)定性好。4℃放置保存一年粒徑無(wú)變化，包封率仍在90％以上。同時(shí)該方法便于滅菌及除去熱原，可規(guī)模生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、制備多層脂質(zhì)體將注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)，膽固醇和DSPE-PEG2000分別溶于氯仿中，將三者混合，摩爾比為1.5∶0.5∶0.06。將上述混合液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在125mM，pH5硫酸銨溶液中。
2、制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓。擠壓使用不同孔徑的碳纖維膜。用5％蔗糖pH5平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3、制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將一定量的注射用鹽酸柔紅霉素溶于5％蔗糖液中，在65℃下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體液中混合，在65℃水浴中放置15分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖，除去游離的鹽酸柔紅霉素。藥/脂比為0.1∶1(w/w)。最后過(guò)0.22微米的微孔膜除菌、熱原及其他雜質(zhì)。即得到鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例21、制備多層脂質(zhì)體將注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)，膽固醇和DSPE-PEGG2000分別溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，將三者混合，摩爾比為1.5∶0.5∶0.06。將上述混合液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在200mM，pH5.5硫酸銨溶液中。
2、制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓。擠壓使用不同孔徑的碳纖維膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3、制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將一定量的注射用鹽酸柔紅霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體液中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖，除去游離的鹽酸柔紅霉素。藥/脂比為0.2∶1(w/w)。最后過(guò)0.22微米的微孔膜除菌、熱原及其他雜質(zhì)。即得到鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例31、制備多層脂質(zhì)體將注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)，膽固醇和DSPE-PEG2000分別溶于氯仿中，將三者混合，摩爾比為2.5∶1.5∶0.2。將上述混合液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在250mM pH6硫酸銨溶液中。
2、制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓。擠壓使用不同孔徑的碳纖維膜。用15％蔗糖pH6平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3、制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將一定量的注射用鹽酸柔紅霉素溶于15％蔗糖液中，在65℃下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體液中混合，在65℃水浴中放置45分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖，除去游離的鹽酸柔紅霉素。藥/脂比為0.15∶1(w/w)。最后過(guò)0.22微米的微孔膜除菌、熱原及其他雜質(zhì)。即得到鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例41、制備多層脂質(zhì)體將注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)，膽固醇和DSPE-PEG2000分別溶于氯仿/甲醇液中(v/v，2∶1)，將三者混合，摩爾比為2.5∶1.5∶0.2。將上述混合液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在200mM pH5.5硫酸銨溶液中。
2、制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓。擠壓使用不同孔徑的碳纖維膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3、制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將一定量的注射用鹽酸柔紅霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體液中混合，在65℃水浴中放置60分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖，除去游離的鹽酸柔紅霉素。藥/脂比為0.2∶1(w/w)。最后過(guò)0.22微米的微孔膜除菌、熱原及其他雜質(zhì)。即得到鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
實(shí)施例51、制備多層脂質(zhì)體將注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)，膽固醇和DSPE-PEG2000分別溶于氯仿中，將三者混合，摩爾比為2∶1∶0.1。將上述混合液體放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，再將該膜浸泡在200mMpH5.5硫酸銨溶液中。
2、制備小單層脂質(zhì)體將上述液體放入擠壓機(jī)中多次擠壓。擠壓使用不同孔徑的碳纖維膜。用10％蔗糖pH5.5平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
3、制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將一定量的注射用鹽酸柔紅霉素溶于10％蔗糖液中，在65℃下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入小單層脂質(zhì)體液中混合，在65℃水浴中放置30分鐘。冷卻至室溫，經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖，除去游離的鹽酸柔紅霉素。藥/脂比為0.2∶1(w/w)。最后過(guò)0.22微米的微孔膜除菌、熱原及其他雜質(zhì)。即得到鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體成品。
本方法是利用鹽酸柔紅霉素在硫酸銨梯度作用下與硫酸根形成膠樣沉淀物，非常穩(wěn)定地存在于脂質(zhì)體水相中。由于大豆氫化卵磷脂是高相變溫度磷脂(Tm＝52℃)，在65℃條件下形成液態(tài)，使鹽酸柔紅霉素進(jìn)入脂質(zhì)體水相中。在低于52℃條件下則形成結(jié)晶態(tài)，使包裹其中的鹽酸柔紅霉素不易滲漏。因此本方法制得的鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體在4℃條件下保存一年后包封率仍在90％以上，脂質(zhì)體粒徑均勻無(wú)變化。
采用本發(fā)明工藝所制成的成品經(jīng)檢測(cè)鹽酸柔紅霉素的包封率為95％以上，回收率90％，磷脂，膽固醇及DSPE-PEG2000的回收率為85％左右。
以人白血病細(xì)胞系HL60進(jìn)行的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)表明作用48小時(shí)后，柔紅霉素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死量IC50＝0.056μg/ml，脂質(zhì)體柔紅霉素IC50＝0.077μg/ml。作用72小時(shí)后，柔紅霉素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死量IC50＝0.003μg/ml，脂質(zhì)體柔紅霉素IC50＝0.005μg/ml。因柔紅霉素從脂質(zhì)體中緩慢釋放，二者無(wú)顯著差別。但體內(nèi)毒性試驗(yàn)表明，脂質(zhì)體顯著降低了柔紅霉素的毒性。以昆明小鼠進(jìn)行的毒理實(shí)驗(yàn)表明，柔紅霉素的小鼠半數(shù)致死量LD50＝5.453mg/k0g，脂質(zhì)體柔紅霉素組在藥量上升至18mg/kg時(shí)，僅有20％的小鼠死亡。此外，體內(nèi)生物代謝實(shí)驗(yàn)表明，脂質(zhì)體柔紅霉素在血中的濃度約為游離藥物的5倍。維持較高的血藥濃度使脂質(zhì)體柔紅霉素更易到達(dá)腫瘤組織。體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)表明，脂質(zhì)體柔紅霉素較游離柔紅霉素具有更好的抗腫瘤效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液，它由脂質(zhì)體膜和包埋在其中水相的鹽酸柔紅霉素組成，鹽酸柔紅霉素和脂質(zhì)體膜的藥/脂比例(w/w)最高為0.2∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射液，其特征在于所述脂質(zhì)體膜基本上由注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)組成。
3.一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液的生產(chǎn)工藝，其特征在于它包括以下步驟(1)制備多層脂質(zhì)體配制注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇及多聚乙烯-乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)的氯仿或氯仿/甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，加入硫酸銨溶液水化；(2)制備小單層脂質(zhì)體將步驟(1)得到的含有多層脂質(zhì)體的硫酸銨溶液經(jīng)擠壓機(jī)擠壓成均勻的小單層脂質(zhì)體液，除去脂質(zhì)體外的硫酸銨；(3)制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體將注射用鹽酸柔紅霉素溶入濃度為5～15％蔗糖液中，在65℃條件下將鹽酸柔紅霉素蔗糖液加入到小單層脂質(zhì)體液中，水浴15～60分鐘，使鹽酸柔紅霉素進(jìn)入小單層脂質(zhì)體中，冷卻至室溫，除去蔗糖和游離的鹽酸柔紅霉素得到成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(1)中注射用大豆氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和DSPE-PEG2000三者的摩爾比為1.5～2.5∶0.5～1.5∶0.06～0.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(1)中硫酸銨溶液的濃度為125～250mM，pH值為5～6。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的pH值優(yōu)選5.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中除去脂質(zhì)體外的硫酸銨是指用濃度為5～15％蔗糖pH 5～6平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫脂質(zhì)體外的硫酸銨。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的pH值優(yōu)選5.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(3)中的蔗糖液的濃度優(yōu)選為10％。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(3)中除去蔗糖是指用經(jīng)0.9％氯化鈉溶液平衡的Sephadex G-50柱層析洗脫蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液及其生產(chǎn)工藝。該注射液由脂質(zhì)體膜和包埋在其中水相的鹽酸柔紅霉素組成，鹽酸柔紅霉素和脂質(zhì)體膜的藥/脂比例(w/w)最高為0.2∶1。該生產(chǎn)工藝包括(1)制備多層脂質(zhì)體；(2)制備小單層脂質(zhì)體；(3)制備鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是按照本方法生產(chǎn)的鹽酸柔紅霉素脂質(zhì)體注射液毒性小、包封率高、穩(wěn)定性好。
文檔編號(hào)A61K31/7028GK1504195SQ0215374
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2002年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者馬潔, 曹利人, 馬 潔 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所, 北京文卓醫(yī)藥生物制品技術(shù)開發(fā)有限公司