專利名稱：一種黃芪提取物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種黃芪提取物；此外，本發(fā)明還涉及該黃芪提取物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病的并發(fā)癥之一 HAAF是糖尿病患者難以獲得接近正常血糖控制的重要障礙。數(shù)據(jù)顯示為了減少I型糖尿病遠(yuǎn)期并發(fā)癥而采用的胰島素強(qiáng)化治療使得低血糖的發(fā)生率增加了近3倍。HAAF產(chǎn)生的機(jī)制主要是反復(fù)發(fā)作的低血糖大大削弱了腎上腺素、胰高糖素等反向調(diào)節(jié)激素對(duì)低血糖的應(yīng)急調(diào)節(jié)，使得交感腎上腺系統(tǒng)對(duì)低血糖的反應(yīng)明顯遲鈍，并且由于神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)低血糖的敏感性下降，患者自身往往對(duì)低血糖癥狀缺乏覺(jué)醒，尤其是睡眠過(guò)程中患者經(jīng)常會(huì)在不自知的狀態(tài)中血糖持續(xù)走低直至死亡，這一現(xiàn)象被命名為低
血糖相關(guān)的自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)失敗-簡(jiǎn)稱HAAF(Hypoglycemia-Associated Autonomic
Failure)。HAAF的存在使得患者低血糖的發(fā)生率明顯上升，而反復(fù)發(fā)生的低血糖又會(huì)進(jìn)一步加重HAAF的程度，如此以來(lái)往往會(huì)陷入一個(gè)惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響著患者的血糖控制。國(guó)外目前以耶魯大學(xué)為首的幾所著名內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室均在積極探討HAAF發(fā)生的機(jī)制及應(yīng)對(duì)措施，但在治療方面尚無(wú)突破性進(jìn)展。而治療領(lǐng)域則主要是尋找能夠重建機(jī)體腎上腺素、去甲腎上腺素、胰高糖素對(duì)低血糖的反應(yīng)，提高機(jī)體對(duì)低血糖的預(yù)警機(jī)制的有效成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種黃芪提取物，可以用于治療糖尿病并發(fā)癥之一 HAAF，能夠部分重建機(jī)體腎上腺素、去甲腎上腺素對(duì)低血糖的反應(yīng)，提高機(jī)體對(duì)低血糖的預(yù)警機(jī)制。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供上述黃芪提取物的制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供上述黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對(duì)低血糖荷爾蒙反向調(diào)節(jié)受損的藥物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種黃芪提取物，含有黃芪甲甙IV，其含量不低于 O. 08mg/ml。中醫(yī)學(xué)無(wú)HAAF這一病名，但是低血糖狀態(tài)的乏力、心慌、肢冷、出汗甚至昏迷等現(xiàn)象和中醫(yī)范疇的陽(yáng)氣暴脫極為相似，屬于脫癥的一種，多因久病消渴，氣虛漸至陽(yáng)虛，一個(gè)意外的原因或者治療不當(dāng)陽(yáng)氣脫于外，氣衰而見(jiàn)乏力委頓，陽(yáng)衰不能斂陰，則汗液妄泄，心氣不足則心慌驚惕，甚者汗出如油，伴有肢冷、脈微、呼吸低弱甚至意識(shí)不清等見(jiàn)癥，均合于陽(yáng)氣衰微所致。因此益氣升陽(yáng)是其法，黃芪首當(dāng)其屬。其次在臨床實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)常低血糖發(fā)作的患者往往伴有氣虛見(jiàn)證，經(jīng)過(guò)黃芪 (包括黃芪膠囊及黃芪注射液)治療后患者的低血糖發(fā)生次數(shù)較前明顯減少，血糖相對(duì)較為穩(wěn)定，因此提示黃芪能夠通過(guò)某些機(jī)制對(duì)抗HAAF。本發(fā)明的黃芪提取物，它是由一組有效成分組成，所述有效成分主要是皂甙類，特別是黃芪甲甙IV。本發(fā)明所涉及的原料藥材黃芪為中國(guó)藥典2000年版一部所收載中藥，并符合藥典質(zhì)量要求。本發(fā)明還提供上述黃芪提取物的制備方法，包括如下步驟(I)將黃芪原藥材加水煎煮3次，每次I. 5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至每 Iml相當(dāng)于原藥材I 2g ;(2)以75%及85%的乙醇兩次沉淀，每次均冷藏放置12小時(shí)，回收乙醇并濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材IOg,用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原藥材O. 75 Ig,冷藏放置12 小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材5 6g,放冷；(3)用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5 分鐘，趁熱濾過(guò)，加注射用水，濾過(guò)，再用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6. 0-7. 5，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得。本發(fā)明黃芪提取物通過(guò)上述水醇法提取制備，即水提取，醇沉淀法，并且使用兩次醇沉，使該提取液中黃芪甲甙IV的含量不低于O. 08mg/ml，PH值約為6. 0-7. 5，可直接進(jìn)入大鼠靜脈系統(tǒng)。本發(fā)明的黃芪提取物在使用時(shí)，可以將其濃縮液滅菌后按照常規(guī)制劑方法制備成口服液，也可以將其干燥后與藥學(xué)上常用的輔料制備成顆粒劑、膠囊劑、片劑、沖劑等。所述輔料包含稀釋劑如乳糖、木糖醇、甘露醇、甲殼胺等，根據(jù)選擇劑型的不同，可以按照現(xiàn)有的常規(guī)制劑方法(《藥物制劑方法》，張勁主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年8月出版)選擇不同的輔料?？梢赃x擇的崩解劑如羧甲基淀粉鈉CMS-Na、微晶纖維素等；粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、低取代羥丙基纖維素(L-HPC)、聚乙二醇(PEG)等； 穩(wěn)定劑如山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸酯、乙醇、枸櫞酸等；包合劑如ο-環(huán)糊精(a-⑶)、p-環(huán)糊精 (P-CD)和N-LOK變性淀粉等；包衣劑如羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、丙烯酸樹(shù)脂等；矯味劑如蜂蜜、蔗糖等。在上述各種劑型藥物的每日劑量中，黃芪提取物的含量比例因劑型的不同又很大差別，以其中的黃芪甲甙IV作為其有效成分含量標(biāo)準(zhǔn)，要保證成人每日服藥量中含有黃芪甲甙IV 2.4mg及以上。本發(fā)明還提供上述黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對(duì)低血糖荷爾蒙反向調(diào)節(jié)受損的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明黃芪提取物在HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中能夠部分重建腎上腺素、 去甲腎上腺素對(duì)低血糖的反應(yīng)曲線，胰高糖素也隨之輕度升高；在正常老鼠的低血糖鉗夾過(guò)程中也可使腎上腺素、去甲腎上腺素升高水平明顯高于對(duì)照組。證明本發(fā)明中的黃芪有效組分具有重建HAAF模型大鼠部分荷爾蒙反應(yīng)的作用。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)了該有效組分能夠激活大腦PVN、VMH、NTS等糖敏感部位的C-Fos基因蛋白表達(dá)，尤其是對(duì)下丘腦CRF神經(jīng)核團(tuán)的激活，從而提高了機(jī)體對(duì)低血糖的預(yù)警機(jī)制。本發(fā)明對(duì)糖尿病的并發(fā)癥之一 HAAF具有很好的治療前景。


圖I-圖3是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例I中黃芪有效組分對(duì)HAAF模型大鼠低血糖鉗夾過(guò)程中荷爾蒙的重建示意圖，包括腎上腺素(圖I)，去甲腎上腺素(圖2)以及葡萄糖輸注率(圖 3)。圖4-圖5是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中黃芪有效組分對(duì)正常大鼠腦組織糖敏感部位的激活作用示意圖，包括PVN、NTS部位的c-Fos染色，以及PVN部位CRF與c-Fos的雙重染色。圖6是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中黃芪組及對(duì)照組c-Fos基因在PVN及NTS部位的表達(dá)情況示意圖。圖7是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3中PVN部位CRF、Fos雙重染色示意圖，圖7a中標(biāo)尺長(zhǎng) 200 μ m，圖7b中標(biāo)尺長(zhǎng)30 μ m。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述實(shí)施例I取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材lg，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時(shí)，回收乙醇并濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原藥材O. 75g,冷藏放置12小時(shí),濾過(guò),濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材 5g，放冷，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘， 趁熱濾過(guò)，加注射用水使成1000ml，濾過(guò)，再用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. O 7. 5， 濾過(guò)，灌封，滅菌，即得。實(shí)施例2取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材2g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時(shí)，回收乙醇并濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原藥材lg，冷藏放置12小時(shí),濾過(guò),濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材6g, 放冷，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘，趁熱濾過(guò)，加注射用水使成1000ml，濾過(guò)，再用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. O 7. 5，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得。實(shí)施例3取黃芪原藥材2000g，加水煎煮三次，每次I. 5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材I. 5g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75%，第二次為 85%，每次均冷藏放置12小時(shí)，回收乙醇并濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材10g，用注射用水稀釋至每Iml相當(dāng)于原藥材O. 9g,冷藏放置12小時(shí),濾過(guò),濾液濃縮至每Iml相當(dāng)于原藥材
5.5g，放冷，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 5，煮沸，加入O. 125%的活性炭，煮沸5分鐘，趁熱濾過(guò)，加注射用水使成1000ml,濾過(guò),再用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. O
7.5，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得。以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明的有益效果作進(jìn)一步的闡述實(shí)驗(yàn)例I黃芪有效組分對(duì)HAAF模型大鼠荷爾蒙重建作用I、藥物該實(shí)驗(yàn)組使用藥物均是按照實(shí)施例I制備的黃芪提取物，每I毫升液體含生藥2 克，黃芪甲甙IV含量不低于O. 08毫克。對(duì)照組使用的藥物是等體積無(wú)菌生理鹽水。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及HAAF動(dòng)物模型造模SD大鼠，全部來(lái)自耶魯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體重300g_350g，12-12小時(shí)晝夜節(jié)律
飼養(yǎng)，常規(guī)飲食。造模方法(參照 Feeding and neuroendocrine responses after recurrent insulin-induced hypoglycemia. Physiol Behav. 2006 Apr 15 ；87 (4) :700-6. Epub 2006 Feb 21等文獻(xiàn))連續(xù)3天早上9AM給予大鼠正規(guī)胰島素腹腔注射，使之每次低血糖狀態(tài)(PG < 2. 8mmol/L)持續(xù)2小時(shí)左右。其中第一天胰島素劑量為10U/Kg，第二天胰島素劑量為 9U/Kg，第三天降至6U/Kg。具體劑量可以根據(jù)動(dòng)物的實(shí)際情況予以調(diào)整。每隔15分鐘尾端采血測(cè)血糖，如血糖持續(xù)一小時(shí)仍高于2. 8mmol/L者，重新給予半量胰島素腹腔注射，同時(shí)盡量避免動(dòng)物因低血糖誘發(fā)癲癇發(fā)作或死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后恢復(fù)動(dòng)物正常進(jìn)食。3、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)第I天，大鼠在麻醉情況下于胸鎖關(guān)節(jié)上方開(kāi)一 Icm切口，左側(cè)頸動(dòng)脈和右側(cè)頸內(nèi)靜脈分別放置自制心臟套管，交叉繞過(guò)頸部，動(dòng)脈PVP封管，靜脈肝素鹽水封管，以備每天注射黃芪或生理鹽水使用。術(shù)后恢復(fù)3天，從實(shí)驗(yàn)第4天開(kāi)始每天通過(guò)靜脈留置套管給藥，比照60公斤成人體重黃芪常規(guī)用量，按照體表面積換算法，I. 5ml原液稀釋至3ml，(含生藥約3克)，對(duì)照組給等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第8天開(kāi)始連續(xù)三天動(dòng)物造模。實(shí)驗(yàn)第10天動(dòng)物當(dāng)晚5PM開(kāi)始禁食，實(shí)驗(yàn)第11天進(jìn)行低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正規(guī)胰島素微泵推注，通過(guò)調(diào)整葡萄糖推注速率使目標(biāo)血糖維持在2. 8mmol/L左右。兩組大鼠開(kāi)管后預(yù)置一小時(shí)，待其充分安靜下來(lái)，分別微泵給予黃芪注射液和生理鹽水推注30分鐘，速率20ul/min，30分鐘后接通胰島素和糖。從O分鐘開(kāi)始每隔30分鐘取一次大樣以供各種荷爾蒙檢測(cè)之用，每隔10分鐘取小樣一次，檢測(cè)中心血糖， 根據(jù)血糖及時(shí)調(diào)整葡萄糖用量。鉗夾實(shí)驗(yàn)共持續(xù)120分鐘。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)黃芪的干預(yù)，HAAF模型大鼠在低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中荷爾蒙得到了很大程度的重建，具體見(jiàn)表I及圖I-圖3。如圖I所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中顯示黃芪組腎上腺水平明顯高于對(duì)照組。如圖2所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中顯示黃芪組去甲腎上腺水平明顯高于對(duì)照組。如圖3所示，HAAF模型大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中顯示黃芪組需糖量略低于于對(duì)照組。表I黃芪組與對(duì)照組60-120分鐘各種荷爾蒙平均水平比較(X 土SD) (pg/ml)腎上腺素去甲腎上腺素胰高糖素腎上腺皮質(zhì)激素
黃芪組(n=9) 對(duì)照組(n=10)2303. 33±652. 94 1417. 20±606. 32**970. 30±623. 94 510. 20±173· 83*213. 59±138· 12 133. 17±65. 54906. 33±201. 28 693. 81 ±120. 54注與對(duì)照組比較，*p < O. 05，林P < O. 01實(shí)驗(yàn)例2黃芪有效組分對(duì)普通大鼠低血糖鉗夾過(guò)程中荷爾蒙的影響I、藥物及動(dòng)物來(lái)源均同實(shí)驗(yàn)例I2、實(shí)驗(yàn)方法手術(shù)方法同實(shí)驗(yàn)例1，動(dòng)物無(wú)需造模，實(shí)驗(yàn)第7天開(kāi)始每天通過(guò)靜脈留置套管給藥，比照60公斤成人體重黃芪常規(guī)用量，按照體表面積換算法，I. 5ml原液稀釋至3ml，(含生藥約3克)，對(duì)照組給等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第10天動(dòng)物當(dāng)晚5PM開(kāi)始禁食，實(shí)驗(yàn)第11天進(jìn)行低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。采用20% 葡萄糖和20mU/min/kg的正規(guī)胰島素微泵推注，通過(guò)調(diào)整葡萄糖推注速率使目標(biāo)血糖維持在2.8mmol/L左右。兩組大鼠開(kāi)管后預(yù)置一小時(shí)，待其充分安靜下來(lái)開(kāi)始高胰島素低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程不再推注黃芪提取液，其他同實(shí)驗(yàn)例I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體見(jiàn)表2及圖4-圖5。如圖4所示，正常大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中顯示黃芪組腎上腺素水平明顯高于對(duì)照組。如圖5所示，正常大鼠低血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)中顯示黃芪組需糖量明顯低于對(duì)照組。表2黃芪組與對(duì)照組60-120分鐘各種荷爾蒙平均水平比較^土 SD) (pg/ml)
腎上腺素去甲腎上腺素胰高糖素黃芪組(η=7)4460. 18 ±2012. 39739. 33 ±540. 97326. 11 ±207. 05對(duì)照組(η=6)2613. 06±1117· 21*564. 83±250. 41237. 28±110· 54注與對(duì)照組比較，*p < O. 05實(shí)驗(yàn)例3腦組織切片染色腦組織切片PBS清洗10分鐘，放入PBT-疊氮化物(PBT-azide)溶液中，加入O. 3% 新鮮驢血清和I : 10000兔抗FOS抗體過(guò)夜。次日PBS清洗后分別放入加有生物素?；H抗兔血清和O. 3%新鮮驢血清的PBT溶液中以及加有抗生物素蛋白生物素?；^(guò)氧化物酶混合物(ABC-Elite試劑盒，Vector實(shí)驗(yàn)室；1 250)的PBT溶液中各反應(yīng)一小時(shí)，最后用0.04% 3,3’ -二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB ；Sigma)and O. 003%過(guò)氧化氫顯色,鏡檢成功后封片，完成C-Fos的染色。腦組織切片PBS清洗10分鐘，放入PBT-azide溶液中，加入O. 3%新鮮驢血清和 I 500羊抗-FOS抗體以及I : 1000的生物素?；疌RF抗兔血清避光過(guò)夜。次日PBS 清洗后加入含有I : 1000生物素?；H抗兔血清和O. 3%新鮮驢血清的PBT中避光孵化一小時(shí)，最后加入含有O. 3%新鮮驢血清以及I : 1000亞歷山大熒光594共軛抗生蛋白鏈菌素和I : 400亞歷山大熒光488驢抗兔抗體的PBT溶液中避光反應(yīng)一小時(shí)，完成C-Fos 和CRF神經(jīng)核團(tuán)的染色。上述染色方法均經(jīng)多次驗(yàn)證，染色穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比黃芪組下丘腦PVN、NTS部位C-Fos基因表達(dá)明顯活躍，見(jiàn)圖6，黃芪組CRF神經(jīng)核團(tuán)染色與c-Fos 雙重染色后可見(jiàn)其共同表達(dá)于同一細(xì)胞當(dāng)中，說(shuō)明其有效激活了 CRF神經(jīng)核團(tuán)，而對(duì)照組 CRF神經(jīng)核團(tuán)中則幾乎看不到c-Fos的表達(dá)，見(jiàn)圖7。由此我們推測(cè)黃芪注射液存在某種機(jī)制能夠通過(guò)促進(jìn)PVN分泌CRF，提高機(jī)體在低血糖狀態(tài)下兒茶酚胺的水平，從而對(duì)HAAF有效。
權(quán)利要求
1.一種黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對(duì)低血糖荷爾蒙反向調(diào)節(jié)受損的藥物中的應(yīng)用，所述黃芪提取物含有黃芪甲甙IV，其含量不低于O. 08mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃芪提取物在制備防治糖尿病患者對(duì)低血糖荷爾蒙反向調(diào)節(jié)受損的藥物中的應(yīng)用，所述黃芪提取物含有黃芪甲甙IV，其含量不低于0.08mg/ml。本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明中的黃芪有效組分具有重建HAAF模型大鼠部分荷爾蒙反應(yīng)的作用，能夠激活大腦中PVN、NTS等糖敏感部位以及激活CRF神經(jīng)核團(tuán)，從而提高了機(jī)體對(duì)低血糖的預(yù)警機(jī)制。該發(fā)明對(duì)糖尿病的并發(fā)癥之一HAAF具有很好的治療前景。
文檔編號(hào)A61K36/481GK102600230SQ20121006192
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日
發(fā)明者周里鋼, 桑珍, 范曉寧 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院