專利名稱：用于制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法。
目前，一些基于銀杏葉提取物的標(biāo)準(zhǔn)植物藥物制劑被用來治療腦及外周血管性疾病，尤其是在歐洲、美國及遠(yuǎn)東。
目前使用最為廣泛的銀杏提取物(EGb761)含有24％的黃酮糖苷；3％的銀杏內(nèi)酯(ginkgolide)A、B、C和J的總和以及3％的白果內(nèi)酯(bilobalide)(參見K.Drieu，La Presse Medicale(1986)，15，1455-1457)。患者的推薦日劑量為120mg。
例如，美國專利5,399,348介紹了一種用于制各銀杏提取物的方法，所述提取物的平均組成為24％的黃酮糖苷，3％的銀杏內(nèi)酯A、B、C和J以及3％的白果內(nèi)酯。這種方法包括以下步驟i.萃取用含有以重量計(jì)40％的水的丙酮萃取干葉粉末；ii.去脂在減壓條件下濃縮萃取物直至濃縮物含有約30％的固體，從而除去丙酮，然后用水稀釋以使固體濃度為15％，使所得到的懸浮液冷卻至約10℃持續(xù)1小時(shí)，然后過濾除去脂質(zhì)沉淀；iii.富集有機(jī)相向水性過濾液中加入30％的硫酸銨溶液，然后用甲乙酮和丙酮的混合物(9∶1至4∶6)進(jìn)行液-液萃取并濃縮有機(jī)相，以使固體濃度為50％至70％；iv.除去鞣質(zhì)用水和乙醇的以重量計(jì)50/50的混合物稀釋以上濃縮物，以使固體濃度為10％，加入鉛鹽水溶液直至溶液顏色從棕褐色變成琥珀色，并過濾鉛-鞣質(zhì)沉淀物以得到透明的過濾液；v.清除不溶性硫酸鹽形式的鉛濃縮以上過濾液以使乙醇比例保持在5％以下，加入硫酸銨使其濃度達(dá)到約20％，隨后用甲乙酮和乙醇的混合物(8∶2至1∶1)進(jìn)行液-液萃??；和vi.干燥終產(chǎn)物濃縮有機(jī)相以使固體濃度為50％至70％，并在60至80
℃的烘箱中于真空下干燥，以分離得到含水低于5％的終產(chǎn)物。
在過去的十年中，已有許多研究致力于富集銀杏提取物中的活性化合物部分并同時(shí)降低長鏈烷基酚類致敏化合物如銀杏酚酸部分。
有相當(dāng)數(shù)量的專利申請以及專利都介紹了可用來獲得富含黃酮糖苷和萜烯內(nèi)酯的銀杏葉提取物的方法。
例如，美國專利5,389,370涉及用于制備濃縮了活性化合物的提取物的方法。其中所使用的方法是將通過液-液萃取而獲得的富含黃酮糖苷的部分與用柱色譜分離得到的白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯混合，以獲得所需的組合物，所述組合物通常含有50％的黃酮糖苷和6％的白果內(nèi)酯；50％的黃酮糖苷和7％的銀杏內(nèi)酯；或者50％的黃酮糖苷和6％的白果內(nèi)酯以及7％的銀杏內(nèi)酯。所述方法采用了上述美國專利5,399,348的方法的前兩步(其在此定義為步驟1和2)，接著加入了以下連續(xù)的步驟3.富集有機(jī)相用乙酸乙酯和己烷(9∶1)的混合物進(jìn)行液-液萃取，再用正丁醇重新萃取水相，并將得到的正丁醇相濃縮至干燥，以獲得富含黃酮糖苷的部分；4.活性碳處理用水洗滌乙酸乙酯-己烷相，然后用活性碳處理洗過的乙酸乙酯-己烷相，過濾并濃縮至干燥；5.重結(jié)晶將固體殘?jiān)芙庠谝灾亓坑?jì)50/50的乙醇和水的混合物中，冷卻結(jié)晶并過濾，以獲得銀杏內(nèi)酯；6.柱色譜分離將步驟5的上清液濃縮至干燥，并在硅膠柱上進(jìn)行色譜分離，以獲得富含銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的部分；和7.混合各部分將步驟3的富含黃酮糖苷的部分與步驟5或6的銀杏內(nèi)酯和/或與步驟6的白果內(nèi)酯混和。
根據(jù)以上方法的一個(gè)實(shí)施方案，步驟4和5可用柱色譜代替。
此外，美國專利6,030,621介紹了一種用于獲得富含黃酮糖苷和萜烯內(nèi)酯的銀杏提取物的方法，所使用的方法與美國專利5,389,370中的方法類似將富含黃酮糖苷的部分與通過柱色譜法獲得的富含萜烯內(nèi)酯的部分混合。通常，所制備的提取物包含47.2％的黃酮糖苷和6.3％的萜烯內(nèi)酯，或者70％的黃酮糖苷和10％的萜烯內(nèi)酯。此方法包括以下步驟a)萃取用含有以重量計(jì)50％的水的乙醇萃取干葉粉末；b)脫脂在減壓條件下濃縮提取物直至除去乙醇，用水稀釋濃縮物，將混合物靜置48小時(shí)，并過濾脂質(zhì)沉淀；c)捕集活性化合物使水性濾液通過由XAD-4樹脂(多孔聚合物的混合物)和聚酰胺的混合物組成的樹脂，以收集活性化合物；d)洗脫活性成分依次用含有以重量計(jì)30、60和90％的乙醇的乙醇/水混合物洗提活性化合物；和e)合并步驟d中得到的所有部分，蒸發(fā)除去乙醇，用己烷洗滌此水性濃縮物，并將洗過的水性濃縮物蒸發(fā)至干燥，以獲得含有47.2％的黃酮糖苷和6.3％的萜烯內(nèi)酯的提取物。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，對從含有30％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分進(jìn)行快速色譜分離，以獲得至少含80％的萜烯內(nèi)酯的部分。以同樣的方式，將從含有60％乙醇和90％乙醇的乙醇/水混合物中得到的部分合并，并對其進(jìn)行快速色譜分離，以獲得至少含80％的黃酮糖苷的部分。將至少含80％黃酮糖苷的部分與至少含80％萜烯內(nèi)酯的部分以不同的比例混合，可以獲得含有高達(dá)70％的黃酮糖苷和10％的萜烯內(nèi)酯的提取物。
由于健康安全的要求日益嚴(yán)格，所以希望使用盡可能純的活性成分。因此，銀杏提取物的趨勢終將是停止使用如EGb761的提取物而使用更加富含活性成分的提取物。通常，可能的目標(biāo)提取物是含有至少以重量計(jì)50％的黃酮糖苷和以重量計(jì)12％的萜烯內(nèi)酯，或是含有至少以重量計(jì)30％的萜烯內(nèi)酯和以重量計(jì)15％的黃酮糖苷。美國專利5,389,370或6,030,621的方法可用來獲取這種提取物，但是當(dāng)用于工業(yè)規(guī)模時(shí)，所述方法卻被證明是非常復(fù)雜的，主要是因?yàn)椴捎昧松V分離的步驟。
本申請人已開發(fā)了一種不使用任何色譜分離步驟而獲得符合上述標(biāo)準(zhǔn)的銀杏葉提取物的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是用于制備銀杏葉提取物的方法，其包含以下連續(xù)的步驟i.用含水以重量計(jì)不超過20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii.在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物，并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii.用正己烷、正庚烷或環(huán)己烷進(jìn)行液-液萃取，以洗滌殘余的水溶液；iv.用乙酸乙酯對洗滌過的水相進(jìn)行液-液萃??；v.用氯化鈉溶液洗滌步驟iv中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗滌過的乙酸乙酯相蒸發(fā)至干燥。
本申請中的干燥的銀杏葉碎片是指粒度不超過5mm的干燥碎片。
優(yōu)選地，本發(fā)明的干燥的銀杏葉碎片是干粉末的形式。在本申請中，粉末是指粒度不超過1mm的粉末(優(yōu)選不超過5mm)。
本發(fā)明的方法可用于-凍干的銀杏葉碎片(優(yōu)選粉末)，在該情況下可獲得含有至少以重量計(jì)50％的黃酮糖苷和以重量計(jì)12％的萜烯內(nèi)酯的提取物；-或干燥的銀杏葉碎片(優(yōu)選粉末)，在該情況下可獲得在下文中被稱為“主要提取物”的提取物，所述主要提取物含有至少以重量計(jì)30％的萜烯內(nèi)酯和以重量計(jì)15％的黃酮糖苷(用所述方法還可以獲取所述提取物的相關(guān)產(chǎn)品-在下文中被稱為“相關(guān)提取物”，即與PCT專利申請WO96/33728中介紹的提取物類似的提取物，它含有以重量計(jì)約30至35％的黃酮糖苷和以重量計(jì)約1％的萜烯內(nèi)酯)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述方法被用于凍干的銀杏葉碎片(或粉末)，并且所獲得的提取物優(yōu)選含有以重量計(jì)約52％的黃酮糖苷和以重量計(jì)約13％的萜烯內(nèi)酯。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，上述方法被應(yīng)用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，并且所獲得的主要提取物優(yōu)選含有以重量計(jì)34至46％的萜烯內(nèi)酯和以重量計(jì)18至30％的黃酮糖苷。更為優(yōu)選的是，將上述方法應(yīng)用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，所獲得的主要提取物含有以重量計(jì)36至44％的萜烯內(nèi)酯和以重量計(jì)18至30％的黃酮糖苷。特別地，上述方法被應(yīng)用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)，所獲得的主要提取物將含有以重量計(jì)約40％的萜烯內(nèi)酯(其中含有以重量計(jì)約24.5％的銀杏內(nèi)酯A、B和C和以重量計(jì)15.5％的白果內(nèi)酯)和以重量計(jì)約24％的黃酮糖苷。
優(yōu)選地，步驟i中的提取是用含有以重量計(jì)10至20％水的乙醇、更優(yōu)選含有以重量計(jì)15至20％水的乙醇進(jìn)行的。
優(yōu)選地，將步驟ii中在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮后得到的混合物冷卻至例如約10℃的溫度，優(yōu)選持續(xù)10或15分鐘至1或2小時(shí)，然后再從所得的透明溶液中除去黑色油狀物。更優(yōu)選的是，可將硅藻土加入步驟ii中在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮后得到的混合物中，并在冷卻此混合物之前將其中存在的所有乙醇蒸發(fā)除去。
同樣優(yōu)選的是，步驟iii中的洗滌使用的是正庚烷。
根據(jù)本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，當(dāng)將所述方案用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)時(shí)，對步驟iii中經(jīng)洗滌的剩余水溶液的體積和溶液中氯化鈉的量預(yù)先進(jìn)行調(diào)整，一方面使水溶性固體的含量以重量計(jì)達(dá)到約溶液總重量的8％，另一方面使氯化鈉的含量以重量計(jì)達(dá)到溶液總重量的16％。水溶性固體的含量的測定方法是取乙醇溶液樣本，蒸發(fā)除去乙醇，然后用二氯甲烷萃取，將殘余的水相蒸發(fā)至干燥并稱重，然后可以從所獲得的固體殘余物的質(zhì)量推導(dǎo)出水溶性固體的含量。
步驟iv中，可以任選使用含有以體積計(jì)2至10％的丙酮或乙醇的甲基乙基酮替代乙酸乙酯。
步驟ii和v中所使用的氯化鈉水溶液的濃度優(yōu)選含有以重量計(jì)至少10％的氯化鈉，而對于步驟v，氯化鈉的濃度優(yōu)選是飽和的。
根據(jù)應(yīng)用于干燥的銀杏葉碎片(或粉末)的上述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在步驟iv的液-液萃取結(jié)束時(shí)獲得的鹽水溶液相可通過一種方法進(jìn)行再處理，所述方法包括a)用約1∶1的乙酸乙酯和乙醇的混合物進(jìn)行液-液萃??；和b)將步驟a)結(jié)束時(shí)獲得的有機(jī)相蒸發(fā)至干燥；c)將步驟b)中所獲得的剩余物溶解于無水乙醇中，以使固體濃度相對于醇溶液的質(zhì)量以重量計(jì)約為5％至10％。
d)將混合物冷卻至優(yōu)選10℃或10℃以下(例如2至8℃)的溫度，優(yōu)選冷卻時(shí)間持續(xù)30分鐘至12小時(shí)；e)過濾并蒸發(fā)所得到的過濾液中的乙醇，以得到干燥的提取物。
應(yīng)用這種附加的方法可以回收得到附加的提取物，其通常含有以重量計(jì)約30至35％的黃酮糖苷和以重量計(jì)約1％的萜烯內(nèi)酯。
或者，上述方法在步驟i至v之后，還包括以下步驟vivi.將干燥的提取物增溶于乙醇中，并將溶液冷卻至優(yōu)選10℃或10℃以下(例如2至8℃)的溫度，如果有鹽沉淀產(chǎn)生，則過濾除去鹽沉淀，并將得到的溶液蒸發(fā)至干燥。
在這種情況下，當(dāng)將本發(fā)明的方法用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選的方法是在步驟v中僅將有機(jī)相濃縮至固體濃度為約50％至70％(而不是將其蒸發(fā)至干燥)，然后加入乙醇以使組成為以重量計(jì)5至20％的水、以重量計(jì)5至20％的固體，其剩余的為乙醇，然后再進(jìn)行步驟vi。按照這種方式進(jìn)行可省略干燥步驟。
本發(fā)明所獲得的主要提取物可用于制藥或食品行業(yè)(例如作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑的成分)。因?yàn)橐环矫嫠鼈兊耐榛椒宇愇镔|(zhì)的含量低于5ppm(HPLC測量結(jié)果)，另一方面，它們含有低于0.3％的前翠雀素(prodelphinidine)(優(yōu)選低于0.25％，一般為0.05％至0.25％)。此外，它們還含少量的親脂性雜質(zhì)和多糖、除前翠雀素外的其它原花色素(proanthocyanidine)以及高分子量蛋白。
特別地，由于其前翠雀素的含量低，本發(fā)明的主要提取物更適于通過靜脈途徑向患者施用。相比之下，市售的提取物如EGb761等含有高達(dá)1.5％的前翠雀素。
此外，優(yōu)選本發(fā)明的主要提取物的色譜圖中對應(yīng)于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積的和占色譜峰總面積的約39％。具體地講，優(yōu)選本發(fā)明的主要提取物的色譜圖中對應(yīng)于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積占色譜峰總面積的約20％。類似地，優(yōu)選本發(fā)明的主要提取物的色譜圖中對應(yīng)于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)的峰面積占色譜峰總面積的約19％。
此外，使用本發(fā)明的方法所得的相關(guān)提取物含有低于0.5％的前翠雀素(優(yōu)選低于0.4％，一般為0.15至0.40％)。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是可通過本發(fā)明的方法獲得的主要提取物。本發(fā)明的主題還有作為藥物的所述主要提取物、包含所述主要提取物作為活性成分的藥物組合物以及所述主要提取物用于制備藥物的用途，所述藥物可用來治療選自以下的疾病/障礙腦和外周血管障礙(如血管源性耳鳴、動脈硬化、局部缺血、血栓、與靜脈機(jī)能不全有關(guān)的癥狀、急性靜脈炎癥以及與痔疾有關(guān)的癥狀)、神經(jīng)退化性疾病(如例如阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病或肌萎縮性側(cè)索硬化癥)以及老年慢性神經(jīng)感官和認(rèn)知性病理缺陷(尤其是在未患阿爾茨海默氏病或其它癡呆的老年病人中可見的記憶喪失)。最后，本發(fā)明的主題是所述主要提取物用于制備藥物的用途，所述藥物可為治療增殖性疾病(尤其是癌癥)提供輔助治療。
含有本發(fā)明提取物的藥物組合物可以是固體形式如，例如粉末劑、丸劑、顆粒劑、片劑、脂質(zhì)體、明膠膠囊或栓劑。丸劑、片劑或明膠膠囊可以用一種物質(zhì)進(jìn)行包衣，所述物質(zhì)能夠保護(hù)組合物在足夠的時(shí)間段內(nèi)免受受試者的胃酸或胃中的酶的作用，以使這種組合物能夠未經(jīng)消化而進(jìn)入受試者的小腸。所述提取物也可以局部施用，例如施用于腫瘤的實(shí)際部位。所述提取物也可以根據(jù)緩釋方法施用(例如使用緩釋組合物或滲透泵)。合適的固體載體包括磷酸鈣、硬脂酸鎂、碳酸鎂、滑石粉、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯呲咯烷酮和蠟。
含有本發(fā)明提取物的藥物組合物也可以是液體形式如，例如溶液劑、乳劑、混懸液或緩釋制劑。適合的液體載體可以是例如水、有機(jī)溶劑如甘油或乙二醇類如聚乙二醇，或在水中的這些有機(jī)溶劑的不同比例的混合物。
本發(fā)明的藥物的施用可以通過局部、口服、胃腸外途經(jīng)、經(jīng)肌肉內(nèi)注射等方式進(jìn)行。
本發(fā)明的提取物用于治療上述疾病或障礙時(shí)的劑量隨施用方法、待治療患者的年齡和體重及其身體狀況而變化，并且最終由醫(yī)生或獸醫(yī)決定。這種由醫(yī)生或獸醫(yī)所確定的量在此被稱為“治療有效量”。
如果預(yù)先不考慮醫(yī)生的意見，根據(jù)主要提取物中的活性成分的含量，可以例如設(shè)計(jì)施用的日劑量為5至150mg、優(yōu)選10至100mg(特別是40至80mg，例如50至70mg的劑量)的所述主要提取物。
在本申請中，術(shù)語“約”指的是所討論數(shù)值周圍的一個(gè)區(qū)間。如本申請中所使用的“約X”表示從X減X的10％到X加X的10％的區(qū)間，并更優(yōu)選從X減X的5％到X加X的5％的區(qū)間。
除非特別指明，這里所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解的含義相同。同樣，所有在此提及的出版物、專利申請、專利以及其它參考資料在此引入作為參考。
以下實(shí)施例旨在闡明上述方法而不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1將100克凍干研碎的銀杏葉(粒度小于4mm)用含有以重量計(jì)88％的乙醇的乙醇/水混合物萃取兩次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下進(jìn)行1小時(shí)。將兩次萃取步驟的萃取液過濾，回收剩余的葉片并用200ml相同的溶劑混合物洗滌。合并萃取液并將其蒸發(fā)使體積減少至100ml，其中固體產(chǎn)物的含量約35g。將350ml 10％(重量)的氯化鈉水溶液加入到醇濃縮物中，并在50℃下繼續(xù)減壓蒸發(fā)以除去剩余的乙醇。將淺桔黃色的透明鹽溶液傾析通過過濾漏斗中的棉毛球然后抽吸濾過硅藻土而與黑色油狀物分離，將鹽水溶液中的提取物用每份150ml的正庚烷洗滌兩次，然后再用每次150ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯相并用50ml飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后減壓蒸發(fā)至干燥。將干提取物重新溶解于60ml的無水乙醇中，置于5℃的冰箱中過夜，過濾以除去可能生成的沉淀鹽并將過濾物蒸發(fā)至干燥，得到1.42g含有51.7％的黃酮糖苷和13％的萜烯內(nèi)酯(6.55％的白果內(nèi)酯)的提取物。
實(shí)施例2將100g在工業(yè)轉(zhuǎn)爐中干燥并經(jīng)研碎的銀杏葉(粒度小于4mm，含有以重量計(jì)1.8％的黃酮糖苷和以重量計(jì)0.12％的銀杏內(nèi)酯)用含有以重量計(jì)80％的乙醇的乙醇/水混合物萃取兩次，第一次用800ml，第二次用600ml，每次都在60℃下進(jìn)行1小時(shí)。將兩次萃取步驟的萃取液過濾，回收剩余的葉片并用200ml相同的溶劑混合物洗滌。合并萃取液并將其蒸發(fā)使體積減少至800ml，其中固體產(chǎn)物的含量約33g。將60g氯化鈉、100ml水和22g硅藻土加入到醇濃縮物中，并在50℃下繼續(xù)減壓蒸發(fā)以除去剩余的乙醇。將水性濃縮物冷卻至10℃持續(xù)1小時(shí)。將淺桔黃色的透明鹽溶液傾析通過過濾漏斗中的棉毛球、然后在覆蓋有一層硅藻土的燒結(jié)玻璃漏斗上抽吸過濾而與黑色油狀物分離。用兩份125ml的正庚烷洗滌鹽水溶液(約300ml)中的提取物，然后再用每次125ml的乙酸乙酯萃取兩次。合并乙酸乙酯相并用50ml飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后減壓蒸發(fā)至干燥。將干燥的提取物重新溶解于23ml無水乙醇中，置于4℃的冰箱中過夜，過濾以除去可能生成的鹽沉淀并將過濾物蒸發(fā)至干燥，得到1.06g含有23.6％的黃酮糖苷、39.2％的萜烯內(nèi)酯(包括24.6％的銀杏內(nèi)酯A、B和C以及14.5％的白果內(nèi)酯)和約0.14％的前翠雀素的提取物。
實(shí)施例3
在制備實(shí)施例2的提取物的方法中，經(jīng)正庚烷清洗并用乙酸乙酯萃取的連續(xù)步驟后而獲得的水相鹽溶液再用兩份125ml的乙酸乙酯-乙醇的1∶1混合物萃取，將所獲得的有機(jī)相蒸發(fā)至干燥。將干燥的提取物置于無水乙醇中以使干燥提取物的濃度以重量計(jì)為溶液總重的5％。將混合物置于4℃的冰箱中過夜，然后用濾紙過濾(用4℃的無水乙醇沖洗固體)。蒸發(fā)至干燥后，得到含有31.88％的黃酮糖苷和0.67％的萜烯(含0.5％的銀杏內(nèi)酯A、B和C和0.17％的白果內(nèi)酯)以及約0.21％的前翠雀素的提取物。
本發(fā)明提取物的鑒定A)HPLC本發(fā)明的提取物可以使用高效液相色譜法(HPLC)鑒定，洗脫梯度如下儀器-適合以下所指定條件的液相色譜儀及設(shè)備-實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿-精確度至0.1mg的天平試劑-純水(HPLC級)-乙腈(HPLC級)-異丙醇(HPLC級)-檸檬酸(HPLC級)-甲醇R-銀杏提取物標(biāo)準(zhǔn)對照物步驟將200mg待分析的提取物溶解于10ml甲醇中，制得待測提取物溶液。以相同的方法將200mg銀杏提取物標(biāo)準(zhǔn)對照(EGb 761)溶解于10ml甲醇中，制得參比溶液。
使用了以下色譜條件
-梯度類型 二級流動相從0％至100％線性梯度15分鐘，然后以二級流動相洗脫5分鐘。在進(jìn)行以下進(jìn)樣前用基礎(chǔ)流動相將色譜柱重新平衡10分鐘。
-基礎(chǔ)流動相純水1000ml乙腈200ml異丙醇 30ml檸檬酸 4.92g-二級流動相純水1000ml乙腈470ml異丙醇 50ml檸檬酸 6.08g-流速 1.5ml/分鐘-檢測 紫外360nm-色譜柱不銹鋼，15cm長，直徑4.6mm，填充有色譜用Macherey-Nagel R Nucleosil 5C18硅膠或同等物(5μm)。
-進(jìn)樣體積 5μl結(jié)果所得到的實(shí)施例2提取物的色譜圖由

圖1所示，實(shí)施例3的提取物的色譜圖由圖2所示。
以下表I(實(shí)施例2的提取物)和表II(實(shí)施例3的提取物)中列出了所測定的不同色譜峰的積分值。在上述條件下，主峰的保留時(shí)間約為13至15分鐘，分別對應(yīng)于O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-四羥基-3’，4’，5，7-黃酮醇(或槲皮素3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)和O-吡喃鼠李糖基-4-O-D-(反-p-香豆酰-6)吡喃葡萄糖基氧基-3-三羥基-4’，5，7-黃酮醇(或莰非醇3-(6-反-p-香豆酰)-葡萄糖鼠李糖苷)。
表I
表II
B)測定前翠雀素的含量本發(fā)明提取物的前翠雀素含量按照以下所述方法進(jìn)行測定將約50mg提取物溶解于25ml異丙醇和3N鹽酸(5/1v/v)的混合物中。將5ml所得到的混合物轉(zhuǎn)移至10ml燒瓶中，用液密塞子密封，然后將燒瓶浸于沸水中45分鐘。冷卻至20℃后，加入異丙醇與3N鹽酸的混合物使體積增至10ml。測量556nm處的吸光度并通過進(jìn)行以下運(yùn)算得到前翠雀素的百分含量前翠雀素％＝A×86.206897/BA556nm處的吸收度B樣品毫克數(shù)為降低結(jié)果的不確定性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并由所得結(jié)果計(jì)算平均值。
本發(fā)明提取物的藥理學(xué)特性為證實(shí)本發(fā)明提取物的藥理學(xué)特性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
1)細(xì)胞繁殖細(xì)胞系MDA-231乳癌細(xì)胞系得自Lombardi癌癥中心(喬治敦大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)。將這些細(xì)胞在聚苯乙烯培養(yǎng)皿(Corning)中培養(yǎng)并在添加了10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)中進(jìn)行增殖。
結(jié)合實(shí)驗(yàn)將MDA-231細(xì)胞通過研磨分散于5ml磷酸鹽緩沖的鹽水溶液(PBSS)中，然后在500g下離心15分鐘。將經(jīng)過離心的細(xì)胞重新懸浮于PBSS中并進(jìn)行測試以確定它們的蛋白含量?？梢园凑铡癙apadopoulos等人，生物化學(xué)雜志，1990年，265期，3772-3779頁”和“Hardwick等人，癌癥研究，1999年，59期，831-842頁”中所述的方法進(jìn)行[3H]PK11195實(shí)驗(yàn)。[N-甲基-3H]PK11195或(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-異喹啉甲酰胺得自Du Pont-New England Nuclear(Wilmington，DE，美國)。PK11195得自Research Biochemicals Incorporated(Natick，MA，美國)。所得到的結(jié)果用LIGAND軟件(Munson and Robard，Anal.Biochem.(1976)，72，248-254)進(jìn)行分析。
Northern RNA分析使用“Hardwick等人，癌癥研究，1999年，59期，831-842頁”中所述的Northern分析法，可以對用實(shí)施例1或?qū)嵤├?中的提取物或EGb761(參比)處理的MDA-231細(xì)胞中的外周型苯并二氮雜受體(PBR)的mRNA的表達(dá)進(jìn)行評價(jià)。整體細(xì)胞RNA是使用試劑RNAzolB(TEL-TEST，Inc.，F(xiàn)riendswood，TX，美國)和三氯甲烷進(jìn)行分離的。用1％瓊脂膠分離20μg總體RNA樣品并將其過夜轉(zhuǎn)移至尼龍膜(S&SNytran，Scheicher & Schuell，Keene，NH，美國)上。采用DNA引物的隨機(jī)認(rèn)證系統(tǒng)(Life Technologies，Gaithersbury，MD，美國)，用[α-32P]dCTP標(biāo)記一段0.2kb長的人PBR的cDNA片段(得自含有人PBR全序列的pCMV5-PBR質(zhì)粒載體)。所使用的雜交條件在先前所提及的文獻(xiàn)中述及。自動放射顯影是通過在-70℃下將印記(blots)暴光于X-OMAT AR底片(Kodak，Rochester，NY，美國)達(dá)4至48小時(shí)進(jìn)行的。使用SigmaGel軟件(Jandel Scientific，San Rafel，CA，美國)對PBR mRNA進(jìn)行定量。
細(xì)胞繁殖用添加了0.1％FBS的DMEM作為細(xì)胞培養(yǎng)液，將MDA-231細(xì)胞置于96孔板(Corning，NJ，美國)中，濃度為每孔約10,000細(xì)胞(溫育24小時(shí))或5,000細(xì)胞(溫育48小時(shí))。然后將細(xì)胞在含有不同濃度的待測樣品或參考樣品(EGb761)的10％FBS中培養(yǎng)以上指定的時(shí)間。通過使用ELISABrDu儀器(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，美國)測量結(jié)合的5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)的量，對細(xì)胞繁殖的差異進(jìn)行分析。BrdU的結(jié)合是在450nm的波長下(參比690nm)進(jìn)行測量的。
2)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可按如下方式測試本發(fā)明的提取物用一系列濃度的上述實(shí)施例1或?qū)嵤├?的提取物對大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行處理或未經(jīng)處理，30分鐘后使其與濃度為250 M的谷氨酸接觸。然后計(jì)算抑制50％的谷氨酸毒性的劑量(IC50)，并與用提取物如黃酮糖苷和萜烯內(nèi)酯的含量較低的EGb761得到的結(jié)果進(jìn)行比較(即每ml含EGb761100μg)。
3)細(xì)胞毒性用HT22細(xì)胞系(鼠海馬細(xì)胞)可測量本發(fā)明的提取物對細(xì)胞存活能力的影響。通過測定經(jīng)一系列濃度的上述實(shí)施例1或?qū)嵤├?的提取物處理過的HT 22細(xì)胞釋放出的LDH的量以及錐蟲藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)，可以估計(jì)細(xì)胞的存活能力。
細(xì)胞系HT 22細(xì)胞來自于Salk生物學(xué)研究所(Salk Institute for BiologicalResearch，La Jolla，CA，美國)。將此細(xì)胞用添加有10％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)在37℃下培養(yǎng)。所述培養(yǎng)液在下文中被稱為完全培養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)程序?qū)T 22細(xì)胞置于96孔板中，濃度為每孔完全培養(yǎng)液中含有5×103個(gè)細(xì)胞。24小時(shí)后，將所述實(shí)施例的提取物溶于DMEM中并將其以10、25、50、100、250、500和1000μg/ml的濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，然后使提取物與細(xì)胞接觸24或48小時(shí)。使用Promega分析試劑盒、按照制造商提供的使用說明進(jìn)行LDH的測量。記錄470nm處的吸收度。最高LDH釋放量是用Triton X-100將細(xì)胞完全裂解后得到的。
當(dāng)通過錐蟲藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)估算細(xì)胞的存活能力時(shí)，將細(xì)胞置于6孔板中，并于24小時(shí)后以100g/ml的濃度加入實(shí)施例1或?qū)嵤├?的提取物。
然后用不含鈣及鎂離子的磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，再用胰蛋白酶在37℃下處理5分鐘。用完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并向細(xì)胞懸浮液中加入0.04％的錐蟲藍(lán)。用血細(xì)胞記數(shù)器測定排斥錐蟲藍(lán)的細(xì)胞(即活細(xì)胞)數(shù)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活百分比活細(xì)胞數(shù)(未染色細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)(染色細(xì)胞和未染色細(xì)胞)×100
權(quán)利要求
1.制備銀杏葉提取物的方法，其包括以下連續(xù)的步驟i.用含水以重量計(jì)不超過20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii.在氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物，并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii.用正己烷、正庚烷或環(huán)己烷進(jìn)行液-液萃取，以洗滌殘余的水溶液；iv.用乙酸乙酯對洗過的水相進(jìn)行液-液萃??；v.用氯化鈉溶液洗滌步驟iv中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗過的乙酸乙酯相蒸發(fā)至干燥。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于其不包括色譜分離步驟。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，步驟i中的干銀杏葉碎片用干銀杏葉粉末代替。
4.權(quán)利要求1至3的方法，其特征在于步驟i中的提取是使用含有以重量計(jì)10至20％的水的乙醇進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1至4的方法，其特征在于步驟iii中的洗滌是用正庚烷進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求1至5的其中一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟ii和v中所用的氯化鈉水溶液的濃度為至少含有以重量計(jì)10％的氯化鈉。
7.權(quán)利要求1至6的其中一項(xiàng)的方法，其在步驟i至v后還包括以下步驟vivi.將干燥的提取物溶于乙醇中并使溶液冷卻，過濾可能產(chǎn)生的沉淀鹽并將得到的溶液蒸發(fā)至干燥。
8.銀杏葉提取物，其可以按照權(quán)利要求1至7的其中一項(xiàng)所述的制備方法獲得。
9.權(quán)利要求8的銀杏葉提取物，其特征在于所述方法是從干燥的干銀杏葉碎片開始進(jìn)行的。
10.權(quán)利要求9的銀杏葉提取物，其特征在于其含有以重量計(jì)34％至46％的萜烯內(nèi)酯和以重量計(jì)18％至30％的黃酮糖苷。
11.權(quán)利要求8的銀杏葉提取物，其特征在于所述方法是從凍干銀杏葉的干碎片開始進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求11的銀杏葉提取物，其特征在于其含有以重量計(jì)約52％的黃酮糖苷和以重量計(jì)約13％的萜烯內(nèi)酯。
13.用作藥物的權(quán)利要求8至12的其中一項(xiàng)的銀杏葉提取物。
14.藥物組合物，其包含權(quán)利要求8至12的其中一項(xiàng)的提取物作為活性成分。
15.權(quán)利要求8至12的其中一項(xiàng)的提取物在制備用于治療疾病/障礙的藥物中的用途，所述疾病/障礙選自腦及外周血管障礙和神經(jīng)退化性疾病。
16.權(quán)利要求8至12的其中一項(xiàng)的提取物在制備預(yù)計(jì)用來為治療增殖性疾病提供輔助治療的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備銀杏葉提取物的方法，其包括以下連續(xù)的步驟i)用含水以重量計(jì)至少20％的乙醇提取干燥的銀杏葉碎片；ii)在至少氯化鈉水溶液存在下減壓濃縮提取物并從剩余的透明溶液中除去黑色油狀物；iii)用正己烷、正庚烷或環(huán)己烷進(jìn)行液－液萃取，以洗滌殘余的水相；iv)用乙酸乙酯對洗過的水相進(jìn)行液－液萃?。籿)用氯化鈉溶液洗滌步驟iv)中獲得的乙酸乙酯相，然后將洗過的乙酸乙酯相蒸發(fā)至干燥。
文檔編號A61P9/14GK1501806SQ02808099
公開日2004年6月2日 申請日期2002年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月10日
發(fā)明者鄧朋本 申請人:科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢公司