專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)多肽的制備及其用途，更具體地講，本發(fā)明涉及一種包含 HMGBl (高遷移率族蛋白1) N端氨基酸序列和Exendin-4氨基酸序列的基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高遷移率族蛋白l(High mobility group box 1，HMGB1)廣泛分布于淋巴組織以及腦、肝、肺、心、脾、腎等組織的有核細(xì)胞中。在肝、腦組織的細(xì)胞中，HMGBl主要存在于胞漿，但在大多數(shù)其它組織細(xì)胞中則主要存在于細(xì)胞核，在進(jìn)化過(guò)程中其氨基酸序列高度保守。人類(lèi)HMGBl基因位于13ql2染色體上，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼215個(gè)氨基酸序列(SEQ ID No :1，見(jiàn)基因庫(kù)CAG33144. 1)。HMGBl蛋白由三個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成 (圖1)。其中，“A-box”位于N-末端，進(jìn)化高度保守；“C-tail”在羧基末端，包含30個(gè)重復(fù)的天冬氨酸和谷氨酸殘基，可參與調(diào)節(jié)HMGBl與DNA結(jié)合的親和力；“B-box”位于二者之間。A-box和B-box均由3個(gè)α螺旋組成，并帶有強(qiáng)烈的正電荷，構(gòu)成HMGBl的非特異性 DNA結(jié)合區(qū)。在生理?xiàng)l件下，HMGBl的表達(dá)穩(wěn)定在一定的基礎(chǔ)水平上，其主要功能是作為核因子在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的活性，例如促進(jìn)白介素-6(IL-6)基因的轉(zhuǎn)錄。在組織損傷或發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞(尤其是白細(xì)胞)內(nèi)HMGBl表達(dá)顯著增加，除在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用外， HMGBl還被釋放至細(xì)胞外，它的B-box是引起炎癥反應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，作用緩慢而持久，因此HMGBl又被稱(chēng)為“慢性炎癥因子”。細(xì)胞釋放的HMGBl促進(jìn)組織晚期炎癥反應(yīng)的機(jī)理之一， 是通過(guò)與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)受體RAGE結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)NF-ΙΛ通路，從而刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括TNF-、IL-I、IL-、IL-8、MIP-I以及粘附分子VCAM和ICAM的表達(dá)增加，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)。已有的研究發(fā)現(xiàn)， HMGBl與RAGE作用引發(fā)的這些反應(yīng)可能與糖尿病患者的并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。但是，研究還發(fā)現(xiàn)，正常衰老或凋亡的細(xì)胞不能釋放出HMGB1，因此，目前認(rèn)為HMGBl只能在組織發(fā)生炎癥或損傷后，由破裂的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，是組織慢性炎癥反應(yīng)的主要因素之一。有趣的是，HMGBl中的A_box對(duì)B_box的促炎癥活性具有很強(qiáng)的拮抗作用。A_box 的這種作用是通過(guò)與B-box競(jìng)爭(zhēng)與受體結(jié)合(如RAGE、TLR2、TLR4)、從而減少B-box與細(xì)胞膜上受體的作用而減輕組織的炎癥反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A-box與C-tail融合后， 它的抗炎活性明顯增強(qiáng)，其作用機(jī)制不清楚，可能是由于C-tail的存在能促進(jìn)A-box與受體結(jié)合從而增加后者對(duì)B-box的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。Exendin-4是從一種美洲大毒蜥蜴Gila monster lizard(Heloderma Suspectum) 的唾液腺毒素中分離出來(lái)的由39個(gè)氨基酸組成的多肽(SEQ ID No 2) 0它與GLP-I具有大約53%的結(jié)構(gòu)同源性，能夠與GLP-I的受體結(jié)合。進(jìn)一步的研究表明，該多肽與GLP-I有同樣的促進(jìn)胰島素分泌的功能，但穩(wěn)定性卻明顯高于GLP-1。由美國(guó)Amylin和Lilly制藥公司共同開(kāi)發(fā)、人工合成的Exendin-4 (Exenatide，商品名為Byetta)于2005年4月獲美國(guó) FDA批準(zhǔn)，成為首個(gè)獲準(zhǔn)上市的GLP-I擬似物，主要用于改善二甲雙胍和磺酰脲類(lèi)藥物治療不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。臨床應(yīng)用表明，Exenatide注射后，空腹及餐后血糖均顯著下降，且降糖作用與血糖水平有關(guān)。當(dāng)血糖高于正常時(shí)，其促進(jìn)β細(xì)胞釋放胰島素， 當(dāng)血糖低于正常時(shí)，Exenatide不再顯示進(jìn)一步降糖作用。由此可見(jiàn)，Exenatide優(yōu)于目前所用的磺脲類(lèi)降糖藥，不易發(fā)生低血糖反應(yīng)。Exendin-4與二甲雙胍、磺酰脲類(lèi)藥物、或噻唑烷二酮類(lèi)藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能有效地控制2型糖尿病患者的血糖，而且對(duì)體重還有減輕作用。大量資料表明，Exendin-4在治療糖尿病上具有顯著降血糖、促進(jìn)胰島素分泌和保護(hù)胰島細(xì)胞等作用，且副作用很小，是一種新型的生物制品。由于Exendin-4能增加胰島素的分泌及提高β細(xì)胞質(zhì)量的特性，(^hofaili等研究了 11名進(jìn)行了胰島移植的1型糖尿病患者在使用Exendin-4后的效果。結(jié)果表明，Exendin-4能刺激胰島移植受者的胰島素分泌，在一些患者可減少外源性胰島素的用量，在其他患者則延緩再次需要使用胰島素的時(shí)間，提示Exendin-4未來(lái)的適應(yīng)癥可擴(kuò)展到1型糖尿病患者胰島移植后的輔助治療。更有研究認(rèn)為其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，隨著研究的不斷深入，其臨床適應(yīng)癥可能進(jìn)一步擴(kuò)大。多肽藥物是近年來(lái)生物醫(yī)藥研究的成果之一，多肽藥物的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法和基因工程生產(chǎn)法?；瘜W(xué)合成法主要是固相或液相合成法。固相合成技術(shù)目前已較為成熟，但成本較高，隨著基因工程技術(shù)的成熟，國(guó)內(nèi)外都嘗試用基因工程技術(shù)生產(chǎn)多肽以提高產(chǎn)量，降低成本。用基因工程方法生產(chǎn)中等長(zhǎng)度O0-60個(gè)氨基酸殘基)多肽時(shí)，由于表達(dá)水平低，且容易降解，因此常與其它載體蛋白融合表達(dá)。但由于目的多肽在融合蛋白中所占比例很小，裂解后分離純化困難，影響了基因工程生產(chǎn)多肽藥物的發(fā)展。另一解決途經(jīng)就是把目的多肽的基因串聯(lián)，可以提高產(chǎn)量。但串聯(lián)體切割時(shí)需要大量的酶，間接增加了生產(chǎn)成本。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建各種融合蛋白或單體、串聯(lián)體多肽的報(bào)道迅速增加。同時(shí)，鑒于很多疾病對(duì)于單一藥物的治療效果不佳，國(guó)際上已開(kāi)始研究利用不同藥物或單抗進(jìn)行“雞尾酒”療法，這種給藥方法目前已成為一種新的發(fā)展趨勢(shì)。然而，利用人體自身存在的酶，在體內(nèi)對(duì)多肽藥物進(jìn)行裂解并連續(xù)釋放其有效成分，使之成為可在體內(nèi)產(chǎn)生兩種(或多種)多肽而發(fā)揮不同效應(yīng)并達(dá)到治療同一種疾病的多肽藥物，即所謂“多靶向” 治療藥物尚未見(jiàn)報(bào)道。凝血酶是體內(nèi)存在的一種促進(jìn)血液凝固的重要凝血因子，正常情況下凝血酶主要以酶原形式存在，少量被激活的凝血酶對(duì)于維持血管的正常狀態(tài)具有重要的生理意義。因此，血液中凝血與抗凝血因子必須達(dá)到一定的平衡，以維持正常的血液循環(huán)。若凝血活性太低則導(dǎo)致毛細(xì)血管脆性增加和皮下出血等癥狀；若凝血活性太高，則容易導(dǎo)致血流淤滯甚至發(fā)生血管內(nèi)凝塞。當(dāng)組織或血管發(fā)生損傷或炎癥時(shí)，大量的凝血酶原被激活，局部的血液凝固活性增加，有利于減少出血和促進(jìn)組織修復(fù)。然而，某些疾病如糖尿病和腫瘤，因某些不明機(jī)制造成患者體內(nèi)的凝血酶活性顯著升高，這種病理變化可能直接與這些疾病的并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。已有研究表明，糖尿病患者體內(nèi)的凝血酶活性比正常人的高3-10倍， 而實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠的凝血酶活性則比正常大鼠的高達(dá)30倍之多！這種病理變化對(duì)于原發(fā)疾病有何意義尚不清楚。綜上所述，HMGBl的Α-box多肽通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制B_box序列與受體結(jié)合，能有效地發(fā)揮抗炎作用，減少細(xì)胞的炎癥因子產(chǎn)生和減輕炎癥對(duì)組織造成的損傷和癥狀，從而可以減緩原發(fā)疾病(如糖尿病)并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。Exendin-4是一種此GLP-I更有效、作用時(shí)間更長(zhǎng)的降糖物質(zhì)，主要通過(guò)促進(jìn)胰島素合成和分泌以及促進(jìn)β細(xì)胞增殖等機(jī)制而改善高血糖問(wèn)題，具有治療糖尿病的功效。這些具有藥用功能的蛋白質(zhì)多肽可以通過(guò)人工合成，也可以通過(guò)基因工程技術(shù)，用原核或真核表達(dá)的辦法大量生產(chǎn)。相比之下，人工合成技術(shù)成本較高，而基因工程技術(shù)生產(chǎn)多肽的成本較低，且能大規(guī)模生產(chǎn)。因此，將A-box和 Exendin-4兩種多肽以一種含有凝血酶切割位點(diǎn)的序列連接成為嵌合多肽，使之能在凝血酶活性增高的患者體內(nèi)迅速被分解成A-box和Exendin-4兩種多肽，分別發(fā)揮抗炎和降低血糖的功能，達(dá)到雙靶向治療效果，這種嵌合多肽在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種既能抗炎又能改善高血糖或?qū)Ω哐且鸬募膊【哂蟹乐巫饔玫囊环N雙靶向作用的嵌合多肽及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種具有雙靶向作用的嵌合多肽，該嵌合多肽包括三段片段片段1、片段2和片段3，其中，片段1是HMGBl從N端計(jì)起的前 20-90個(gè)氨基酸序列，也即從人HMGBl多肽的N端第一個(gè)氨基酸殘基算起的20-90個(gè)氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，其包含凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl從N端計(jì)起的前50_90個(gè)氨基酸序列；更優(yōu)選地，在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl從N端計(jì)起的前60-88個(gè)氨基酸序列。在本發(fā)明的嵌合多肽中，所采用的HMGBl蛋白的氨基酸序列可以使已發(fā)表的各種人源性HMGBl肽鏈的氨基酸序列，例如，HMGBl蛋白的氨基酸序列優(yōu)選為SEQ ID No:l所示的序列。如圖1所示，HMGBl蛋白的A-box氨基酸片段優(yōu)選為SEQ ID No 1的N端1_88序列所示的片段。在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段3是一種連接片段，只要其包括凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶、以便水解出具有生理活性的片段1和片段2即可，其本身長(zhǎng)度本發(fā)明嵌合多肽的生理活性基本沒(méi)有影響，所以，連接片段的長(zhǎng)度是可以沒(méi)有限制的；但從制備方便等角度考慮，優(yōu)選地，片段3是是包括凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)的、長(zhǎng)度為5-50個(gè)氨基酸的片段；更優(yōu)選地，片段3是是包括凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)的、長(zhǎng)度為5-25個(gè)氨基酸的片段。優(yōu)選地，在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段3中的二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)位于與 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一側(cè)。在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段2的Exendin-4蛋白的氨基酸序列已在NCBI網(wǎng)站登記，序列號(hào)為AAB22006，具體序列如SEQ ID No 2所示。作為本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
，在本發(fā)明的嵌合多肽中，片段1可以具有如SEQ ID No :9-SEQ ID No 12之一所示的序列，相應(yīng)地，本發(fā)明的嵌合多肽可以具有如SEQ ID No :3-SEQ ID No :8之一所示的序列。本發(fā)明的嵌合多肽的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2。另一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了制備上述具有雙靶向作
5用的嵌合多肽的方法，該嵌合多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域公知多肽合成技術(shù)合成；或者通過(guò)公知的基因工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，具體包括包含編碼該嵌合多肽的核苷酸序列(此序列可通過(guò)PCR 和或人工合成的技術(shù)得到)的表達(dá)載體，在基因工程菌株中表達(dá)并純化得到。上述方法中還可包括任何本領(lǐng)域公知的對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)修飾的步驟。通過(guò)對(duì)本發(fā)明嵌合多肽進(jìn)行體內(nèi)和體外的活性實(shí)驗(yàn)，證明其具有顯著的抗炎和降血糖的活性，完全可以應(yīng)用于制備抗炎和/或降低高血糖的藥物。本發(fā)明的基本原理如下由于這種嵌合多肽含有凝血酶的切點(diǎn)和二肽基肽酶 (DPP-4)的切點(diǎn)，當(dāng)這種嵌合多肽直接用于人體后，在血液中的凝血酶和DPP-4作用下，將其裂解并產(chǎn)生兩種具有藥用活性的多肽，即人HMGBl的N端序列(A-box)和Exendin-4，發(fā)揮不同的治療效果。所產(chǎn)生的人HMGBl的N端序列的多肽發(fā)揮其競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMGBl與受體結(jié)合，從而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，包括抑制1順-、11^-1、11^-、11^-8、10 -1以及粘附分子VCAM 和ICAM的產(chǎn)生，達(dá)到防治由于慢性炎癥而產(chǎn)生的并發(fā)癥，例如糖尿病的并發(fā)癥等；而所產(chǎn)生的Exendin-4則發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的功能，達(dá)到改善高血糖的問(wèn)題，可防治由于高血糖而產(chǎn)生的疾病，包括1型和2型糖尿病等。因此，這種嵌合多肽在體內(nèi)能夠被凝血酶切割而釋放出HMGBl的N端序列(或A-box)和Exendin-4兩種各具藥效功用的多肽，因而具有抗炎和降血糖的雙靶向作用。本發(fā)明的嵌合多肽在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)具有圖3所示的作用機(jī)制。相此于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的嵌合多肽具有以下的有益效果1、在應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的嵌合多肽時(shí)，將不存在生產(chǎn)其他融合蛋白所需的裂解純化的缺點(diǎn)，同時(shí)又可提高該多肽的表達(dá)量。2、這種嵌合蛋白在患者體內(nèi)的連續(xù)性水解能延長(zhǎng)該兩種多肽藥物的半衰期，從而減少用藥次數(shù)。3、這種嵌合蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生的HMGBl蛋白N端序列和Exendin-4多肽分別發(fā)揮兩種不同的作用，形成一種雙靶向疊加效應(yīng)，具有“雞尾酒”設(shè)計(jì)效果。4、由于糖尿病患者血中的凝血酶活性比正常人高3-10倍，本發(fā)明的嵌合多肽尤其適用于糖尿病及其并發(fā)癥，因而針對(duì)性強(qiáng)。


圖1為HMGBl的分子結(jié)構(gòu)，顯示A_box、C_tail和B_box三個(gè)結(jié)構(gòu)域。圖2為本發(fā)明的雙靶向作用嵌合多肽的結(jié)構(gòu)示意圖，包括HMGBl的N端序列、連接片段和Exendiin-4序列。圖3為本發(fā)明的雙靶向作用嵌合多肽在體內(nèi)的作用機(jī)制示意圖。本示意圖列出的本發(fā)明的雙靶向嵌合多肽在體內(nèi)的作用機(jī)制所涉及的酶包括DPP-4、凝血酶、凝血因子X(jué)。 在酶的作用下，該嵌合蛋白釋放出HMGBl的N端序列和Exendin-4兩種多肽，分別具有抗炎和刺激胰島素分泌的作用。圖4為嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解產(chǎn)物對(duì)胰島細(xì)胞株NIT-I細(xì)胞的活性影響。NIT-I細(xì)胞與不同濃度(0，5，10，20，40微克/毫升)的嵌合多肽水解產(chǎn)物(含 HMGBl的N端序列和Exendin-4)共同保溫72小時(shí)后，用MTT法測(cè)定的細(xì)胞活性隨水解產(chǎn)物濃度而增加，提示水解產(chǎn)物對(duì)NIT-I細(xì)胞的增值具有促進(jìn)作用。
圖5為化學(xué)發(fā)光法測(cè)定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物對(duì)NIT-I細(xì)胞的胰島素分泌的影響?！皩?duì)照組”為未加水解產(chǎn)物，“未水解組”為未經(jīng)凝血酶水解的嵌合多肽 (20微克/毫升)，“水解組”為經(jīng)過(guò)凝血酶水解的嵌合多肽水解產(chǎn)物(20微克/毫升)，與 NIT-I細(xì)胞保溫72小時(shí)后測(cè)定上清液的胰島素含量(毫微克/毫升)。本圖顯示只有經(jīng)過(guò)凝血酶水解的嵌合多肽才能刺激NIT-I細(xì)胞分泌胰島素。圖6為RT-PCR法測(cè)定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物對(duì)K562細(xì)胞株 IL-6的mRNA表達(dá)水平的影響。M為DNA長(zhǎng)度梯度，從下至上的條帶為100，200，300，400， 500，600bp ；1為對(duì)照組，2為重組人HMGBl(rhHMGBl) +嵌合多肽水解產(chǎn)物，3為rhHMGBl。本圖顯示rhHMGBl能顯著刺激K562細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-6的mRNA (3)，而當(dāng)嵌合多肽水解物和rhHMGBl同時(shí)存在時(shí)，IL-6的mRNA表達(dá)顯著降低O)，提示嵌合多肽水解物對(duì)rhHMGBl 的活性具有拮抗作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、本發(fā)明嵌合多肽的制備按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，采用基因工程技術(shù)生成由人HMGBl的N端83個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合肽序列，序列如下MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKA RYEREMKTYIPPKGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 3)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中G后面的P還可以是A、 S、V、L0具體制備上述序列的步驟如下(1)利用PCR方法或化學(xué)合成法得到人HMGBl的N端83個(gè)氨基酸和含凝血酶和二肽肽酶酶切位點(diǎn)5個(gè)氨基酸的DNA序列；(2)利用PCR方法或化學(xué)合成法得到含凝血酶和二肽肽酶酶切位點(diǎn)的連接片段和 Exendin-4 的 DNA 序列；(3)將上述兩段序列混合，94°C變性，52°C退火，互為模板延伸，得到嵌合肽的全 DNA序列；(4)用上述嵌合肽的全DNA序列構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌，通過(guò)篩選獲得陽(yáng)性工程菌。以發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)得到嵌合肽的基因工程表達(dá)產(chǎn)物，按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽。2、生理活性實(shí)驗(yàn)部分在PBS溶液中，將凝血酶、二肽基肽酶與本發(fā)明的嵌合多肽共同保溫，37°C，1小時(shí)模擬體內(nèi)水解該嵌合肽，所獲得的酶水解產(chǎn)物進(jìn)行初步的活性測(cè)定或經(jīng)過(guò)凝膠層析分離得到HMGBl的N端肽段和Exenden-4多肽，分別開(kāi)展活性實(shí)驗(yàn)。(1)用MTT法測(cè)定嵌合多肽產(chǎn)生的Exenden-4對(duì)胰島-細(xì)胞株NIT-I細(xì)胞的增值活性影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIT-I細(xì)胞與最終濃度為0，5，10，20，40 μ g/ml的嵌合肽水解產(chǎn)物共同保溫72小時(shí)，除去上清，用MTT測(cè)定細(xì)胞活性，可以觀察到NIT-I細(xì)胞的活性(A 值)隨嵌合肽水解產(chǎn)物的濃度增加而明顯提高，顯示Exenden-4多肽對(duì)NIT-I細(xì)胞的增值具有顯著的促進(jìn)作用(如圖4所示)。(2)用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定嵌合多肽產(chǎn)生的Exenden-4對(duì)胰島-細(xì)胞株NIT-I細(xì)胞的胰島素分泌的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIT-I細(xì)胞，分三組，對(duì)照組加生理鹽水，實(shí)驗(yàn)1組(未水解組)加最終濃度為20 μ g/ml嵌合肽，實(shí)驗(yàn)2組(水解組)加最終濃度為20 μ g/ml嵌合肽水解產(chǎn)物，在37°C保溫72小時(shí)，取上清液用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定胰島素含量，可以觀察到實(shí)驗(yàn)1組對(duì)NIT-I細(xì)胞分泌胰島素?zé)o明顯的影響，但實(shí)驗(yàn)2組的胰島素含量明顯升高，顯示嵌合肽水解產(chǎn)物中的Exenden-4能顯著增加NIT-I細(xì)胞的胰島素分泌(如圖5所示)。(3)用RT-PCR法測(cè)定嵌合多肽產(chǎn)生的HMGBl的N端序列對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)IL-6的 mRNA表達(dá)水平的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，分三組，對(duì)照組加生理鹽水，實(shí)驗(yàn)1組同時(shí)加嵌合肽水解物(20 μ g/ml)和 hrHMGBl (10 μ g/ml)，實(shí)驗(yàn) 2 組加 hrHMGBl (10 μ g/ml)，在 37°C保溫72小時(shí)，收集細(xì)胞并提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。用IL-6引物(forward AAAGAGGCACTGGCAGAAAA, reverse :AACAACAATCTGAGGTGCCC， size :416bp)和-actin 弓丨物 (forward TGGGTCAGAAGGATTCCTATGT, reverse CAGCCTGGATAGCAACGTACA, size :276bp)分析IL-6的mRNA表達(dá)水平?？梢杂^察到對(duì)照組的IL-6表達(dá)水平較低，而實(shí)驗(yàn)2組顯示IL-6 的mRNA水平顯著增高，表明細(xì)胞受hrHMGBl刺激而增加IL-6的合成，而實(shí)驗(yàn)1組的IL-6 的mRNA水平比實(shí)驗(yàn)2組顯著降低，顯示嵌合肽水解產(chǎn)物中的HMGBl的N端序列能顯著抑制 hrHMGBl對(duì)K562細(xì)胞的刺激作用(如圖6所示)。(4)體內(nèi)法鑒定嵌合多肽的降血糖和抗炎作用利用鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為不同濃度給藥組和對(duì)照組，每組10只，分別于腹腔給藥(對(duì)照組注射生理鹽水)，于30min后取尾靜脈血用血糖儀測(cè)定血糖，Ih后用尿糖試紙測(cè)定尿糖，觀察嵌合多肽對(duì)糖尿病大鼠的降血糖效果。另外，采用 ELISA法定量測(cè)定尾靜脈血漿中TNF-、IL-1和IL-6的水平，分析大鼠炎癥因子的產(chǎn)生情況。 該實(shí)驗(yàn)將可觀察到糖尿病大鼠的血糖和尿糖下降，炎癥細(xì)胞因子水平下降。下述實(shí)施例2-6是本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的另外幾種實(shí)現(xiàn)方式，其制備方法均為現(xiàn)有基因工程及核苷酸或氨基酸化學(xué)合成的公知技術(shù)，它們得到的嵌合多肽在與實(shí)施例1中所述的生理活性實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)了不同程度的抗炎活性以及降低血糖的作用。實(shí)施例2按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成由人HMGBl的N端60個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFLVPRGPHGE GTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 4)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實(shí)施例3按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成由人HMGBl的N端40個(gè)氨基酸、12 個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。
本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSELVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 5)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實(shí)施例4按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成由人HMGBl的N端20個(gè)氨基酸、18 個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP SSGAPPPS(SEQ ID No 6)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實(shí)施例5按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成由人HMGBl的N端20個(gè)氨基酸、M 個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。本例嵌合多肽的序列為MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 7)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實(shí)施例6按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成由人HMGBl的N端20個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸連接片段、Exendin-4組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 8)上述序列中，下劃線所示的部分為連接片段，連接片段中的L、V還可以是A、I、M、 F、P、W等，連接片段中G后一位的P還可以是A、S、V、L0實(shí)施例7按照?qǐng)D2的排列設(shè)計(jì)，用化學(xué)合成的方法合成人HMGBl的N端20_90個(gè)氨基酸序列、由3-M個(gè)氨基酸組成的連接片段、Exendin-4序列組成的嵌合多肽，再按常規(guī)方法純化和制備適用于人體的本嵌合多肽藥物成分。實(shí)施例8利用常規(guī)工藝制成含本發(fā)明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)250微克/毫升、500微克 /毫升、750微克/毫升、1000微克/毫升、1500微克/毫升和2000微克/毫升的皮下注射藥物。該藥物在臨床實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
實(shí)施例9利用常規(guī)工藝制成含本發(fā)明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)0. 1微克/毫升、0. 2微克 /毫升、0. 5微克/毫升、1微克/毫升和2微克/毫升的靜脈注射藥物。該藥物臨床實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
權(quán)利要求
1.一種具有雙靶向作用的嵌合多肽，該嵌合多肽由三段片段構(gòu)成片段1、片段2和片段3 ；其中，片段1是HMGBl從N端計(jì)起的前20-90個(gè)氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，其包含凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)位于與 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一側(cè)。
3.如權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1是來(lái)自如SEQID No:l所示的 HMGBl蛋白的從N端計(jì)起的前20-90個(gè)氨基酸序列，所述的片段3是來(lái)自如SEQ ID No:2所示的Exendin-4蛋白的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的嵌合多肽具有如SEQID No:3-SEQ ID No :8之一所示的序列。
5.如權(quán)利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1具有如SEQID No :9_SEQ ID No 12之一所示的序列。
6.一種制備如權(quán)利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通過(guò)多肽合成技術(shù)合成的。
7.一種制備如權(quán)利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通過(guò)構(gòu)建包含編碼所述嵌合多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體，在基因工程菌株中表達(dá)并純化得到。
8.如權(quán)利要求7所述的制備嵌合多肽的方法，其中，所述的核苷酸序列通過(guò)PCR和/或人工合成的手段得到。
9.如權(quán)利要求6或7所述的制備嵌合多肽的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)修飾。
10.如權(quán)利要求1-5之一所述的嵌合多肽在制備抗炎和/或降低高血糖的藥物方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于凝血酶活性的雙靶向作用的嵌合多肽及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的嵌合多肽包括三段片段片段1是HMGB1蛋白從N端計(jì)起的20-90個(gè)氨基酸序列；片段2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的連接片段，包含凝血酶酶切位點(diǎn)和二肽基肽酶的酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的制備方法可以是通過(guò)多肽合成技術(shù)合成或者通過(guò)構(gòu)建包含編碼所述嵌合多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體，在基因工程菌株中表達(dá)并純化得到。本發(fā)明的嵌合多肽具有抑制炎癥反應(yīng)和降低血糖的雙靶向作用，可以應(yīng)用于制備抗炎和/或降低高血糖的藥物。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102443064SQ20111034275
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者劉譽(yù) 申請(qǐng)人:劉譽(yù)