專利名稱：富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別是一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
富勒烯以其獨特的結構和性質(zhì)倍受人們重視，近十年來，幾乎全世界所有著名大學和研究所的科學家都進行了與富勒烯有關的研究。它已成為當今物理、化學、材料及生命科學研究者共同關心的課題。富勒烯的獨特結構賦予了它一些特殊的性質(zhì)。如摻雜堿金屬的富勒烯具有超導性能；富勒烯具有長的三重激發(fā)態(tài)壽命，成為研究激發(fā)態(tài)化學和物理特性的理想平臺；富勒烯能有效地把302轉(zhuǎn)變成102，量子效率幾乎達到100%，從而具有優(yōu)異的抗癌滅菌能力。射頻(RadioFrequency, RF)是一種高頻交流變化電磁波的簡稱,表示可以福射到空間的電磁頻率，頻率范圍從300KHz-30GHz之間。其中13.56MHz最為常用。射頻治療是通過射頻電磁場對人體局部組織進行加熱治療，射頻治療皮膚病、癌腫是皮膚或?qū)嶓w腫瘤透熱治療的一種方式。射頻的治療作用主要是通過感應電作用、電解作用以及熱效應等對組織產(chǎn)生的生物學效應。根據(jù)射頻的生物熱效應原理，射頻作用于生物體后可導致殺死病菌、擴張血管，使血液和淋巴液循環(huán)加快，毛細血管和細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)酶活性提高，新陳代謝加速。增強機體免疫系統(tǒng)的功能，抑制和殺滅某些病原微生物，從而達到活血、抗炎抗癌、消腫之目的。另外，射頻能降低感覺神經(jīng)的興奮性，降低肌肉和纖維結締組織的張力，軟化瘢痕組織，具有解痙止痛效果。與激光比較， 射頻電波有如下特點:(1)選擇性電熱作用:與激光的作用原理不同，射頻轉(zhuǎn)化的熱能產(chǎn)生于組織內(nèi)部，發(fā)射極本身不發(fā)熱，無電流通過人體，所以局部作用溫度低而熱效應高，減輕了對周圍組織的損傷和細胞的破壞，特別是皮下脂肪液化性壞死少，Sadick等稱之為“選擇性電熱作用”；(2)微創(chuàng):透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，射頻電波刀對組織側面的熱損傷深度僅為15 μ m,而普通電刀>650 μ m, C02激光和欽激光均>500 μ m,手術刀雖對組織無熱效應，但有機械損傷；(3)安全:由于射頻對組織細胞的損傷極輕微，故術后恢復快，瘢痕不明顯，無色素沉著。此外，射頻對組織的切割是無壓力切割，切口光滑精細、止血良好、對病變組織氣化完全、無炭化、溫度可調(diào)、視野清晰；(4)用于皮膚科治療特點:無創(chuàng)傷性治療；治療后立刻引起真皮膠原收縮，見效快，治療后效果持久，真皮膠原繼續(xù)增生，多數(shù)可持續(xù)3 6個月，甚至達18 24個月，可調(diào)控其真皮層受熱的深度；治療后患者無需休息、不影響工作；(5)操作方便:由于電極種類多，且可制成各種形狀，工作面可以任意控制，靈巧精確，在身體任何部位均操作方便。此外，多數(shù)電極可重復使用，大大降低了成本。富勒烯在射頻或微波照射的情況下可以產(chǎn)生活性氧，活性氧包括單線態(tài)氧、超氧負離子等。富勒烯的純態(tài)氧發(fā)生的量子產(chǎn)出率(Φ=0.96)顯著高于其他代表性的光敏劑，如亞甲藍(Φ=0.52)、玫瑰紅(Φ=0.83)、曙紅(Φ=0.57)等，并且預測對人體無毒性，因此，被寄予較大期望用作光線力學的療法劑。富勒烯射頻或微波照射下產(chǎn)生活性氧為高度反應性的，并且可以表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，比如裂解細胞中的DNA，抑制細胞的有絲分裂以及生長，還可以抑制細胞蛋白水解酶的活性。由此推斷，富勒烯可以用于腫瘤的治療。射頻或微波照射除了治療腫瘤外，還用于其他很多疾病的治療。所述的皮膚病包括痤瘡、化膿性汗腺炎、嫩膚等，此外還可用于銀屑病、扁平苔蘚、硬化萎縮性苔蘚、硬皮病、皮膚T淋巴細胞瘤、斑禿、尋常疣、Darier’ s病以及皮膚癬菌病等皮膚?。凰龅哪[瘤為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種，目前將富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下治療皮膚病或腫瘤的應用尚未見報道。。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，可有效解決皮膚病的治療用藥問題。本發(fā)明解決的技術方案是，利用富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下發(fā)熱的機理，并結合富勒烯及其衍生物有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學惰性高的特點，實現(xiàn)富勒烯在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病藥物上的應用，所述的富勒烯為富勒烯C6tl，所述的衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物等各種衍生物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz,射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時間為15_30min ；
本發(fā)明有效解決了治療皮膚病或腫瘤的用藥問題，易操作，效果好，外用、口服或靜脈注射富勒烯及其衍生物后 ，在射頻或微波照射下產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導致膜破壞，細胞死亡，從而達到更有效治療皮膚病或腫瘤的目的，是治療皮膚病或腫瘤藥物上的創(chuàng)新。
具體實施例方式本發(fā)明在實施中，是由以下方式實現(xiàn)的。利用基于富勒烯及其衍生物的射頻發(fā)熱及產(chǎn)生活性氧的性能，在13.56MHz射頻或微波照射下的發(fā)熱性能，由射頻功率為300-350W，效率為60-70%的射頻治療儀，照射時間15-30min，在射頻或微波照射后，富勒烯及其衍生物溫度升高10_15°C，產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導致膜破壞，細胞死亡，非常利于達到更有效治療皮膚病的目的，經(jīng)用活性氧檢測試劑盒檢測水溶性富勒烯產(chǎn)生活性氧的性能，測得活性氧水平明顯增高；
富勒烯及其衍生物作為熱敏劑在治療腫瘤藥物中的應用分為體外和體內(nèi)兩部分:
1)將富勒烯及其衍生物溶于水中制成溶液，加入到癌細胞A中進行培養(yǎng)，給藥后3h后用射頻B照射，照射15 30min，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，測定癌細胞A的存活率；
2)將制得的富勒烯及其衍生物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠C體內(nèi)，給藥后3h后用射頻D照射，照射時間為15 30min，測量荷瘤小鼠C的腫瘤體積大小。上述步驟I中的癌細胞(腫瘤)A為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種；
上述步驟I中的射頻B為:頻率范圍為300KHC30GHZ的射頻，最好為13.56MHz、功率300W的射頻。上述荷瘤小鼠C的荷瘤為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種(同癌細胞A)。上述射頻D為:頻率范圍為300KHz 30GHz的射頻，最好為13.56MHz、功率300W的射頻。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物作為熱敏劑來進行熱敏治療體內(nèi)深度腫瘤時，13.56MHz射頻能夠深度穿透生物體，可以用于治療生物腫瘤。所述的富勒烯及其衍生物在富勒烯及其衍生物的溶液中，以納米聚集物的形式存在。將富勒烯及其衍生物作為治療皮膚病或腫瘤的藥物，通過各種不同的方式給入體內(nèi)，在射頻或微波照射下，用于痤瘡、化膿性汗腺炎、嫩膚、銀屑病、扁平苔蘚、硬化萎縮性苔蘚、硬皮病、皮膚T淋巴細胞瘤、斑禿、尋常疣、Darier’S病以及皮膚癬菌病等皮膚病上。所述的藥物包括化學藥物，蛋白質(zhì)或基因藥物；用于熱動力和藥物結合抑制腫瘤細胞增殖藥物中的應用。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、腫瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以更多的分布在病變部位中，與正常組織相比，它可以長期的高濃度的保留在病變部位中，這樣當采用適當?shù)氖侄问褂蒙漕l進行照射時能夠在病變部位中產(chǎn)生更多的熱，但也會分布在正常的組織器官中，為了避免產(chǎn)生的高溫對正常組織產(chǎn)生損傷，可以通過一些手段來加以改善，比如:可以在富勒烯及其衍生物上裝載一些具有靶向性質(zhì)的靶頭，也可以使用抗體等手段介導，可以使用臨床手段比如說內(nèi)窺鏡的方式來直接輸送載藥系統(tǒng)到達靶組織，聚焦射頻面積等方式。本發(fā)明富勒烯及其衍生物本身有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學惰性高等優(yōu)點。結合射頻或微波照射可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的治療皮膚病的效果，并經(jīng)實驗得到了充分證明，有關情況如下:
1、本發(fā)明藥物射頻下用于治療痤瘡
患者共30例，年齡17 31歲， 其中男8例，女22例，均為面部尋常型痤瘡面部皮損以炎癥性紅斑、丘疹、膿皰、結節(jié)或囊腫為主。按照靳培英的三度四級分類法將痤瘡分為輕、中、重度，I IV級。每周采用本發(fā)明藥物使用射頻治療儀GP699A，先按默認設置的參數(shù)由最小值開始進行，再根據(jù)個人的適應程度，逐步調(diào)節(jié)增大能量，每個部位可反復循環(huán)照射數(shù)遍，以患者感到溫熱而無顯著灼痛為度，時間為20-30min，療程為5次，結束后對志愿者皮損的改善和滿意度進行評價，并記錄不良反應。結果為炎性痤瘡療效表現(xiàn)為炎癥不同程度消退、丘疹膿皰消退或顯著減輕。其中7人痊愈，15人顯效，6人有效，有效率達93%，受試患者自我評價均在“好”或“很好”。試驗結果表明，射頻下對炎性痤瘡具有較好的治療作用。2、本發(fā)明藥物射頻下用于治療面頸部皮膚皺紋和松弛的療效和安全性。30例皮膚老化志愿者，每2周使用Alum — FAcEs射頻治療儀用本發(fā)明藥物照射面頸部皮膚皺紋和松弛I次，共6次，分別在治療前、治療第4、6次時(即完成3次、5次治療后)以及治療結束后I個月對志愿者皮損的改善和滿意度進行評價，并記錄不良反應。結果為:24例志愿者治療3次后總有效率66.7%，5次后總有效率90.5%，停止治療后I個月，總有效率94.4%。志愿者滿意度評價:治療3次后為50.0%，5次后為90.5%，停止治療后I個月為100%。治療中主要不良反應為皮膚輕度紫癜?？傻贸鼋Y論:本發(fā)明藥物在射頻下治療面頸部皮膚皺紋和松弛安全、有效。3、本發(fā)明藥物射頻下治療面部增殖性皮膚病
患者共572例，年齡5 79歲，其中男241例，女331例。使用射頻治療儀用本發(fā)明藥物進行手術治療。結果為572例中痊愈527例，顯效28例，痊愈率92.13%，總有效率97.03%，獲得了較好的療效。試驗結果表明，本發(fā)明藥物射頻下切割精確，術中出血少，術后色素沉著不明顯，適用于對精密程度要求較高的面部手術，值得臨床推廣應用。4、本發(fā)明藥物射頻下治 療尖銳濕疣(CA)的臨床療效及其安全性。患者共66例，隨機分為A、B、C3組，其中A組23例，男12例，女11例；B組22例，男12例，女10例。C組21例，男性11例，女性10例。各組患者在性別、年齡、病程、CA體積及數(shù)量方面差異無統(tǒng)計意義，具可比性。A組用本發(fā)明藥物進行射頻治療徹底清除疣體，待患處愈合后按每周3次涂布5%咪喹莫特乳膏，連續(xù)12周為I療程；B組單純進行射頻治療；C組直接進行5%咪喹莫特乳膏，療程同A組。各組患者于治療的1、2周和1、3、6月后進行隨診，統(tǒng)計痊愈率、復發(fā)率及不良反應。結果為A組痊愈率為82.6%，復發(fā)率17.4%，不良反應率 43.5% ；B 組則分別為 45.5%,54.5%,27.3% ；C 組分別為 61.9%,38.1%、42.9%。3 組痊愈率、復發(fā)率差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。A組痊愈率最高復發(fā)率最低，C組次之，B組痊愈最低、復發(fā)率最高，但A、C組不良反應較B組高。試驗結果表明，采用本發(fā)明藥物射頻下治療CA臨床療效好，復發(fā)率低，值得臨床推廣，但要注意減少咪喹莫特外用時的不良反應。5、本發(fā)明藥物射頻消融治療體表脈管性疾病
患者共70例，其中男32例(45.7%)，女38例(54.3%);就診年齡:最小2歲，最大71歲，平均年齡26歲；血管瘤分類:血管瘤24例，其中草莓狀血管瘤14例，混合型血管瘤6例，鮮紅斑痣4例，脈管畸形46例，均為靜脈畸形；病灶分布:頭頸部38例，四肢21例，軀干11例。采用本發(fā)明藥物使用XL-皮膚射頻消融美容儀進行射頻治療。病灶及周邊部位碘伏消毒，2%利多卡因行皮下局部麻醉，根據(jù)患者病變類型、部位、侵犯皮膚的深度和范圍、病變部位血管的形態(tài)等因素，結合術者個人經(jīng)驗選擇不同的電極插入深度和角度、消融時間以及消融功率進行治療。結果為射頻消融治療草莓狀血管瘤、混合型血管瘤、靜脈畸形、鮮紅紅斑痣四脈管性疾病后的有效率分別為78.6%、50%、67.4%,50%,四組療效差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05);射頻消融治療不同面積和不同年齡患者體表脈疾病療效間差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05);病變部位、是否曾接受過其它治療、性別、治療次數(shù)、病程均與療效無關(P >
0.05);射頻消融后77.5%的患者臨床癥狀得到明顯改善，22.5%的患者癥狀改善不明顯。試驗結果表明，采用本發(fā)明藥物射頻消融能夠有效地縮小不同類型體表脈管性疾病的瘤體；病變面積、患者年齡是射頻消融治療體表脈管疾病療效的主要影響因素；射頻消融對于體表脈管性疾病臨床癥狀的緩解具有很好的效果；射頻消融治療體表脈疾病安全性高、副作用少。本發(fā)明富勒烯及富勒烯衍生物使用射頻照射富勒烯-聚乙二醇2000對腫瘤細胞生長的抑制活性的測定:
通過射頻照射的富勒烯-聚乙二醇2000在體外抗腫瘤活性。將PC3前列腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將PC3細胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2，每2 3天傳代一次。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ I，鋪板使待測細胞調(diào)密度至6 X IO3個/ L，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12.5,25,50,100 μ g/ml)的富勒烯-聚乙二醇2000水溶液，設置復孔為4 6個。射頻照射組放置在13.56MHz射頻功率300W的射頻儀中30min，射頻照射結束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，對于非射頻照射組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預冷的10% TCA 200 yl，4°C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測定每孔的OD值。存活率的計算公式:存活率=實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值。已經(jīng)證實當用射頻照射30min，富勒烯-聚乙二醇2000的加入直接影響了 PC3細胞的增殖，抑制率約為90%。射頻照射時，富勒烯-聚乙二醇2000聚合物的體內(nèi)抗腫瘤活性測定
射頻照射時，水溶性富勒烯-聚乙二醇2000的體內(nèi)抗腫瘤活性測定。取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中24只腫瘤體積> 100mm3昆明小鼠，隨機分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；(2)生理鹽水射頻組；(3)富勒烯-聚乙二醇2000組；(4)富勒烯-聚乙二醇2000射頻組。4組均采用靜脈給藥的方式，其中射頻組使用的電磁波頻率為13.56MHz,電壓為300W，給藥3h后射頻照射腫瘤部位，一次照射時間為30min。每2d給藥一次，每次注射生理鹽水或者2mg/ml的富勒烯溶液100 μ 1，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱其體重并使用游標卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，并計算腫瘤體積。結果表明，當給藥富勒烯-聚乙二醇 2000合并射頻照射時，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制。水溶性富勒烯-聚乙二醇2000作為藥物轉(zhuǎn)運載體在制備治療腫瘤藥物中的應用。
取水溶性富勒烯-聚乙二醇2000 IOmg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg，加入超純水2mL，混合均勻后，探頭超聲(工作3s，間隔6s，工作12次，功率為400W)，將探超完成的樣品進行離心(4000rpm，15min)除去大顆粒。得到了水溶性富勒烯為載體的抗腫瘤藥物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)。通過40倍(體積比)乙醇提取出給藥系統(tǒng)中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度計測定作為載體包封的多西紫杉醇的含量，載藥量為2.5mg/mL，實驗表明，水溶性富勒烯-聚乙二醇2000可以吸附抗腫瘤藥物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用。本發(fā)明水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定。本發(fā)明的水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數(shù)設置為0.010，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，以Z平均統(tǒng)計值作為測定結果。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結果。介電常數(shù)設置為79，黏度系數(shù)設置為0.8872，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結果。本發(fā)明水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性，將PC3前列腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將PC3細胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2,每2 3天傳代一次。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ 1，鋪板使待測細胞調(diào)密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8μ g/ml)的水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇，不加入水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇為對照組，設置復孔為4飛個。射頻組放置在13.56MHz射頻中30min，保持射頻照射過程中溫度在37 °C，上下極板距離為30cm，細胞距離上極板為4.5cm。射頻照射結束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對于非射頻照射組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，終止 培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預冷的10% TCA 200 μ 1,4 °C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置10 min，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515 nm處測定每孔的OD值。抑制率的計算公式:抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值。結果表明，本發(fā)明水溶性富勒烯作為藥物載體時能裝載藥物進入腫瘤細胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結合射頻照射后，能夠更明顯的抑制腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明的水溶性富勒烯多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗。本發(fā)明水溶性富勒烯多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2 X IO6個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后，取其中24只腫瘤體積> 100mm3昆明小鼠，隨機分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；(2)多西紫杉醇注射液組；(3)水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇；(4)水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇射頻組。多西紫杉醇注射液組、水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇和水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇射頻組的多西紫杉醇給藥劑量相等，都為25.125mg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中射頻組使用的電磁波頻率為13.56MHz,電壓為300W，給藥3h后射頻照射腫瘤部位，一次照射時間為30min。每2d給藥一次，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱其體重并使用游標卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，并計算腫瘤體積。當給藥水溶性富勒烯多西紫杉醇時，小鼠的腫瘤體積的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明顯的抑制。合并射頻照射時，小鼠的腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實驗的同時，還采用抗腫瘤藥物做了類似的實驗，均取得了相同和相類似的結果，本發(fā)明分組科學，方法穩(wěn)定可靠，其他實驗結果不再一一列舉。本發(fā)明富勒烯及其衍生物可以作為抗腫瘤熱敏治療時的一種良好的熱敏劑，測試表明無論是體外還是體內(nèi)在射頻照射的情況下都可以很好的抑制腫瘤細胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在非射頻照射的情況下富勒烯及其衍生物對正常細胞以及組織毒副作用很小。本發(fā)明富勒烯及·其衍生物可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，本身有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，比表面積大,化學惰性高等優(yōu)點。測試結果表明，本發(fā)明富勒烯及其衍生物作為抗腫瘤藥物的載體時，粒徑均勻，結合射頻照射可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。上述表明，本發(fā)明富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物，預期可以用于治療皮膚病或腫瘤的一種良好的藥物，是藥物制備上的一大創(chuàng)新。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下突出的有益技術效果:
本發(fā)明富勒烯及其衍生物可以作為抗腫瘤治療的一種良好的熱敏劑，射頻照射時產(chǎn)生熱能夠發(fā)揮抗腫瘤活性，可以根據(jù)射頻的聚焦等手段來選擇性的殺傷腫瘤組織和細胞。本發(fā)明提供富勒烯及其衍生物的射頻熱療，可有效實現(xiàn)富勒烯作為熱敏劑和藥物轉(zhuǎn)運載體在腫瘤治療中的聯(lián)合應用，彌補了傳統(tǒng)放化療治療腫瘤的不足，本發(fā)明的研制成功具有實際的臨床意義。本發(fā)明富勒烯及其衍生物射頻或微波照射時產(chǎn)生熱能夠發(fā)揮抗炎殺菌活性，可以根據(jù)射頻的聚焦等手段來選擇性的治療皮膚病。本發(fā)明提供富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下產(chǎn)生活性氧，可有效實現(xiàn)富勒烯及其衍生物對皮膚病的治療，彌補了其他治療皮膚病藥物上的不足，有實際的臨床意義。
權利要求
1.一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，所述的富勒烯為富勒烯C6tl，所述的衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz，射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時間為15_30min。
2.權利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的富勒烯及其衍生物在富勒烯及其衍生物的溶液中，以納米聚集物的形式存在。
3.權利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，其特征在于，用于熱動力和藥物結合抑制腫瘤細胞增殖藥物中的應用，所述的藥物為化學藥物，蛋白質(zhì)或基因藥物。
4.權利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的富勒烯及其衍生物作為熱敏劑制成注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑的一種劑型。
5.權利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的水溶性富勒烯及其衍生物加入生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑的一種中， 制備成制備治療皮膚病或抗腫瘤藥物的劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應用，可有效解決皮膚病的治療用藥問題，方法是，利用富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下發(fā)熱的機理，并結合富勒烯及其衍生物的特點，實現(xiàn)富勒烯在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病藥物上的應用，所述的富勒烯為富勒烯C60，衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物等各種衍生物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz，射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時間為15-30min；本發(fā)明易操作，效果好，外用、口服或靜脈注射富勒烯及其衍生物后，在射頻或微波照射下產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導致膜破壞，細胞死亡，更有效治療皮膚病或腫瘤。
文檔編號A61P17/00GK103191427SQ201310138038
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權日2013年4月19日
發(fā)明者張紅嶺, 史進進, 王蕾, 劉艷, 張振中, 高君, 馬柔柔, 劉瑞瑗, 張靜, 余曉媛, 潘晶晶 申請人:鄭州大學