專利名稱：血調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血調(diào)節(jié)活性并可用于刺激骨髓生長(zhǎng)及治療病毒、真菌和細(xì)菌感染性疾病的新的肽。
有多種調(diào)節(jié)信使及修飾劑如集落刺激因子、干擾素及不同類(lèi)型的肽具有調(diào)節(jié)骨髓生長(zhǎng)的作用[Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，F(xiàn)oa P.，Metcalf D，Polli EE(eds)，Biological Regulation of Cell Proliferation(1986);Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos et al.，Proyr Hemat.1∶341 and 14∶201(1986);Werner et al.，Experientia 42∶521(1986)]。20多年前，Rytomaa and Kivieniemi(Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968))、Rytomaa等人(Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp.106-138(1967))曾報(bào)導(dǎo)成熟粒細(xì)胞的提取物(粒細(xì)胞抑制素)在可特異地抑制復(fù)蓋滑動(dòng)培養(yǎng)物中的大鼠骨髓生長(zhǎng)細(xì)胞增殖。后來(lái)他們證明這種分子量小于3，000道爾頓的因子能夠誘導(dǎo)可移植大鼠粒細(xì)胞白血病的消退，并阻止人白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。
Paukovits和其他一些研究者從大鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)提取了一種類(lèi)似因子并證明它能抑制骨髓細(xì)胞對(duì)滴定的胸苷的攝入(Paukovits，W.R.，Cell Tissue Kinet 4∶539-547(1971);Naturforsch37∶1297(1982))。1979年，Boll等人(Acta Haematologica 6∶130，1979)證明了大鼠粒細(xì)胞提取物對(duì)培養(yǎng)物中人骨髓細(xì)胞的抑制作用，許多其他研究者則證明該粒細(xì)胞粗提取物能在體外抑制嚙齒動(dòng)物骨髓細(xì)胞中之g-CFUC和/或gm-CFUC的發(fā)育。
從理論概念上說(shuō)，該稱為粒細(xì)胞抑制素的生物學(xué)制劑應(yīng)是一種作用于分泌它的同一組織的內(nèi)源性細(xì)胞增殖抑制劑。發(fā)現(xiàn)從粗提取物中得到的這種物質(zhì)沒(méi)有種特異性，但具有很高的組織特異性，而且無(wú)毒并具有可逆的活性。
1982年，有人報(bào)道了一種合成的血調(diào)節(jié)五肽可于體外和體內(nèi)選擇性地抑制骨髓生長(zhǎng)細(xì)胞，且似乎主要是作用于骨髓生長(zhǎng)干細(xì)胞(CFU-gm)(參見(jiàn)Paukovits et al.，Z.Naturforsch 37∶1297，1982和美國(guó)專利4，499，081號(hào))。據(jù)信該肽是以很小量見(jiàn)于骨髓提取物中的天然存在的粒細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子。
1987年，Laerum等人報(bào)導(dǎo)該肽的氧化產(chǎn)物是靠二硫橋鍵形成的二聚體(HP-5)。該二聚體具有與單體相反的作用，即在體外可強(qiáng)烈地刺激人和小鼠CFU-gm集落形成，并在體內(nèi)可向上調(diào)節(jié)小鼠骨髓生長(zhǎng)細(xì)胞。歐洲專利申請(qǐng)87309806.5中提出要求專利保護(hù)該二聚體。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，該二聚體可用于刺激骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)活性降低者的骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)，包括用于治療骨髓損傷、粒細(xì)胞缺乏及因免疫抑制治療以抑制組織排斥反應(yīng)，即骨髓移植外科引起的骨髓功能降低在內(nèi)的再生障礙性貧血。該二聚體也可用于在對(duì)腫瘤和病毒性疾病進(jìn)行細(xì)胞靜止化學(xué)治療和放射治療后促進(jìn)骨髓的迅速再生。對(duì)于因骨髓損傷后缺乏免疫反應(yīng)而發(fā)生嚴(yán)重感染的病人也有特殊的治療價(jià)值。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些對(duì)骨髓生長(zhǎng)細(xì)胞有刺激作用的新的合成肽可用于治療和預(yù)防病毒、真菌及細(xì)菌性疾病。
本發(fā)明包括由下列式(Ⅰ)代表的肽，這些肽具有血液調(diào)節(jié)活性，可用于刺激造血機(jī)能并預(yù)防和治療細(xì)菌、病毒和真菌感染性疾病。
這些肽用于因手術(shù)所致的骨髓抑制、AIDS、ARDS、先天性骨髓發(fā)育不良、骨髓和器官移植等各種臨床狀態(tài)引起的白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低病人，使其恢復(fù)白細(xì)胞計(jì)數(shù);保護(hù)白細(xì)胞減少病人免于遭受感染;治療嚴(yán)重?zé)齻∪思案纳埔蛴媚承┘?xì)胞生命周期特異性抗病毒劑治療骨髓移植病人，特別是患移植物抗宿主性疾病者所引起的骨髓抑制;以及治療結(jié)核病人及動(dòng)物的不明原因性發(fā)熱。該肽也可用于治療和預(yù)防病毒、真菌及細(xì)菌性感染性疾病，特別是處于免疫抑制和“正?！睜顟B(tài)的念珠菌、皰疹及肝炎感染者。
這些化合物也可與共同待批美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/799465和美國(guó)專利No.4499081(已列為本文參考文獻(xiàn))中介紹的單體聯(lián)合使用，以提供骨髓細(xì)胞內(nèi)高或低活性峰的交替出現(xiàn)，從而放大造血功能的天然生理節(jié)律。這樣便可在低骨髓活性期進(jìn)行細(xì)胞靜止治療，以減小骨髓損傷的危險(xiǎn)性，此時(shí)相續(xù)出現(xiàn)的活性峰將會(huì)促進(jìn)骨髓再生。本發(fā)明還包括含有式(Ⅰ)化合物及醫(yī)藥上可接受之載體的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步建立了一種刺激包括人在內(nèi)的動(dòng)物骨髓生長(zhǎng)系統(tǒng)的方法，包括給需要治療的動(dòng)物使用有效量的式(Ⅰ)化合物。
本發(fā)明還建立了預(yù)防和治療處于免疫抑制和正常狀態(tài)之動(dòng)物(包括人)的病毒、真菌及細(xì)菌感染的方法，包括給需要進(jìn)行治療的動(dòng)物服用有效量的式(Ⅰ)化合物。
本發(fā)明的肽是由下列式(Ⅰ)代表的肽及其醫(yī)藥上可接受的鹽
其中Y1和Y2分別是CH2或S;
x是0，1，2，3或4;
m是0，1或2;
n是0，1或2;
A是2-噻吩羧酸、吡啶甲酸、環(huán)己烷羧酸、四氫-2-糠酸、四氫-3-糠酸、2-氧-4-噻唑烷羧酸、環(huán)戊烷羧酸、3-噻吩羧酸、(S)-(+)-5-氧-2-四氫呋喃羧酸、2-哌啶酸、吡咯羧酸、異吡咯羧酸、吡唑羧酸、異咪唑羧酸、三唑羧酸、二硫雜環(huán)戊二烯羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、異噁唑羧酸、噁唑羧酸、噻唑羧酸、異噻唑羧酸、噁二唑羧酸、噁三唑羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、噁嗪羧酸、噁噻唑羧酸、二噁唑羧酸、吡喃羧酸、嘧啶羧酸、吡啶羧酸、噠嗪羧酸、吡嗪羧酸、哌嗪羧酸、三嗪羧酸、異噁嗪羧酸、氧硫氮雜烯(oxathiazene)羧酸、嗎啉羧酸、吲哚羧酸、吲哚恩(indolenene)羧酸、2-異吲哚羧酸、1，5-吡啶羧酸、吡喃并[3，4-b]吡咯羧酸、異吲哚羧酸、吲噁嗪羧酸、苯并噁唑羧酸、苯鄰甲內(nèi)酰胺羧酸、喹啉羧酸、異喹啉羧酸、噌啉羧酸、喹唑啉羧酸、1，5-二氮雜萘羧酸、吡啶并[3，4-b]吡啶羧酸、吡啶并[3，2-b]吡啶羧酸、吡啶并[4，3-b]吡啶羧酸、1，3，2-苯并噁嗪羧酸、1，4，2-苯并噁嗪羧酸、2，3，1-苯并噁嗪羧酸、3，1，4-苯并噁嗪羧酸、1，2-苯并異噁嗪羧酸、1，4-苯并異噁嗪羧酸、咔唑羧酸、吖啶羧酸、或嘌呤羧酸;
B是絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸;
D是賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、b-丙氨酸、肌氨酸或二氨基己炔酸;或羧酰胺或其羥甲基衍生物;
E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或肽鍵;
F是酪氨酸或肽鍵;
或者其中Y1、Y2、x、m、n、C、D、F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、或谷氨酸，而B(niǎo)是絲氨酸;
或其中Y1、Y2、x、m、n、D和F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;而C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸。
或者其中Y1、Y2、x、m、n和F如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸;而D是鳥(niǎo)氨酸;
或者其中Y1、Y2、x、m和n如上定義;
A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸;
B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸;
C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸;
D是鳥(niǎo)氨酸;而F是酪氨酸。
所有上述這些定義的條件是·當(dāng)Y1和Y2是S時(shí)，x是2，3或4，且m和n是1;或·當(dāng)Y1和Y2是CH2時(shí)，x是0，1或2，且m和n是0;或·當(dāng)Y1是S和Y2是CH2時(shí)，x是0且n是1，或·當(dāng)Y2是S和Y1是CH2時(shí)，則x是0且m是1;
·如果當(dāng)C選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸時(shí)，則D便選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸。
本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的適于藥用的鹽配合物。應(yīng)當(dāng)注意的是，式(Ⅰ)中A含末端氨基基團(tuán)，同時(shí)D含有末端羧基或羧酰胺基團(tuán)或其羥甲基衍生物。
本文使用本技術(shù)領(lǐng)域常用縮寫(xiě)字和符號(hào)來(lái)描述該肽Ala＝丙氨酸pGlu＝焦谷氨酸Pro＝脯氨酸
Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Tyr＝酪氨酸Pic＝吡啶甲酸Ppc＝二哌啶酸Ppg＝炔丙基甘氨酸Gly＝甘氨酸Orn＝鳥(niǎo)氨酸P-(NH2)Phe＝對(duì)-氨基苯丙氨酸Hna＝2，6-二氨基-4-己炔酸Lys＝賴氨酸Gln＝谷氨酰胺Arg＝精氨酸Cys＝半胱氨酸Sub＝二氨基辛二酸Pim＝二氨基庚二酸Ser＝絲氨酸Nle＝正亮氨酸Adp＝二氨基己二酸Chc＝環(huán)己烷羧酸Tfc＝四氫-2-糠酸Otz＝2-氧代-4-噻唑烷Cpa＝環(huán)戊烷T(mén)pc＝3-噻吩羧酸
S-otf＝(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸·R-otf＝(R)-(-)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸按照常規(guī)表示法，氨基末端在左邊而羧基末端在右邊。所有手性氨基酸都可以是D或L絕對(duì)構(gòu)型。所有旋光異構(gòu)體都考慮在內(nèi)。
氨基末端都經(jīng)?；饔眉右员Ｗo(hù)。這些保護(hù)基的例子是叔丁氧羰基(t-Boc)，CH3CO和Ar-CO(Ar＝苯甲基或苯基)。
C-末端如天然氨基酸一樣可以是羧基，或可以是羧酰胺-C(O)NH2或羥甲基(-CH2-OH)衍生物。
優(yōu)選化合物是其中A為焦谷氨酸、吡啶甲酸、脯氨酸、酪氨酸或2-哌啶酸;
B為谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸或酪氨酸;
C為天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、或賴氨酸;
D為賴氨酸或其羧酰胺衍生物、精氨酸、N-甲基精氨酸、2，6-二氨基-4-己炔酸、天冬氨酸或鳥(niǎo)氨酸;
E為化學(xué)鍵;
Y1和Y2是CH2;
x是0或2;
m和n是0的化合物。
更優(yōu)選以下化合物是其中A為焦谷氨酸、脯氨酸或吡啶甲酸;
B為谷氨酸、天冬氨酸或絲氨酸;
C為天冬氨酸或谷氨酸;
D為賴氨酸或其羧酰胺衍生物;
E是化學(xué)鍵;
F是化學(xué)鍵;
Y1和Y2是CH2，且x是0或2，以及手性氨基酸為L(zhǎng)絕對(duì)構(gòu)型的化合物。
特別優(yōu)選的是(Pic-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO1](L-Ppc-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO2](pGlu-Ser-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO3](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO4](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO5](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys)2or [SEQ ID NO6](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO7](pGlu-Glu-Asp)2Adp(Tyr-Lys)2[SEQ ID NO8](Pic-Glu-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO9](Pic-Glu-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO10]本發(fā)明的肽用Merrifield的固相技術(shù)制備(J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1964))，或可成功地采用本技術(shù)領(lǐng)域已知的溶液法來(lái)制備。
記載于J.M.Stewart和J.D.Young的“Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Company，Rockford，I L(1984))一書(shū)，或M.Bodansky，Y.A.Klauser和M.A.Ondetti的“Peptide Synthesis”(John Wiley & Sons.Inc.，New York，NY.(1976))一書(shū)中有關(guān)肽的一般合成法均可用于生產(chǎn)本發(fā)明的肽，這些文獻(xiàn)列入本文作為參考文獻(xiàn)。
每種氨基酸或肽均可按肽合成領(lǐng)域中已知方法適當(dāng)加以保護(hù)。例如，最好用α-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(t-Boc)保護(hù)氨基，特別是α位的氨基。可用適當(dāng)取代的苯酯基保護(hù)賴氨酸的ε-氨基，而芐基則可分別用于保護(hù)Asp和Glu的β和γ羧基。適當(dāng)取代的苯酯基保護(hù)基團(tuán)是以氯、溴、硝基或甲基于鄰位和/或?qū)ξ蝗〈?，用于修飾保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)活性。除了t-Boc基團(tuán)外，最常用的是用弱酸處理時(shí)不會(huì)被除去的那些保護(hù)基。這些保護(hù)基可用催化加氫，液氨中的鈉或HF處理這類(lèi)本領(lǐng)域已知方法來(lái)除去。
假如采用固相合成法，則從肽的羧基末端起始，朝氨基末端方向逐步合成該肽?？赏ㄟ^(guò)將經(jīng)保護(hù)的氨基酸的C末端共價(jià)連接到一種適當(dāng)?shù)臉?shù)脂上以開(kāi)始固相合成，這些樹(shù)脂例如是二苯甲基胺樹(shù)脂(BHA)、甲基二苯甲基胺樹(shù)脂(MBHA)或氯甲基樹(shù)脂(CMR)，(如記載于U.S專利No.4244946中的一般樹(shù)脂)或苯基酸氨基甲基樹(shù)脂(PAM)。如果欲使產(chǎn)品肽的羧基末端為羧酰胺，則可使用BHA或MBHA載體樹(shù)脂。如果欲使產(chǎn)品肽的羧基末端為羧基基團(tuán)，則一般可采用ACMR或PAM樹(shù)脂(但該類(lèi)樹(shù)脂也可用于產(chǎn)生羧酰胺或酯)。
用弱酸(即三氟醋酸)處理除去α-氨基上的保護(hù)基團(tuán)。使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的適當(dāng)去保護(hù)反應(yīng)，中和反應(yīng)及偶合反應(yīng)循環(huán)連續(xù)加成氨基酸而無(wú)需分離中間產(chǎn)物，直至形成所需之肽為止。然后使完成的肽去封閉和/或按任何順序從載體樹(shù)脂上裂解下來(lái)。
用HF或HBr/醋酸處理載肽樹(shù)脂，使肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，并產(chǎn)生以羧酸或羧酰胺的形式存在的羧基末端氨基酸。
如果要想得到一種酯，可以于三乙胺存在下用適當(dāng)?shù)拇?、例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苯甲醇處理之，使肽從?shù)脂上裂解下來(lái)并直接得到酯。
也可以從其前體羧酸以常規(guī)方法制備本發(fā)明肽的酯。一般情況下，在有酸催化劑存在下用醇處理該羧酸即可。此外，羧酸也可轉(zhuǎn)化為活化的?；虚g體，如酰鹵，并最好在堿存在下用醇處理之。
從載體樹(shù)脂上裂解肽的優(yōu)選方法是于適當(dāng)?shù)年?yáng)離子清除劑(例如苯甲醚或二甲氧基苯)存在下用無(wú)水HF處理載肽樹(shù)脂。該方法同時(shí)除去所有保護(hù)基(除保護(hù)硫的硫代烷基外)，并從樹(shù)脂上將肽裂解下來(lái)。以該方法從CMR和Pam樹(shù)脂上水解的肽是羧酸，從BHA樹(shù)脂中裂解則得到羧酰胺。
以本領(lǐng)域一般已知方法，通過(guò)烷基化或?；磻?yīng)來(lái)完成對(duì)肽的末端氨基的修飾?？梢栽诮Y(jié)合成肽以前對(duì)氨基酸進(jìn)行這些修飾，或可在肽合成以后，末端氨基釋放但保護(hù)基尚未除去時(shí)對(duì)肽進(jìn)行這些修飾。
一般來(lái)說(shuō)，使用相應(yīng)烷基或芳基酸的酰鹵、酐或活化酯，于叔胺存在下，在游離氨基上完成?；磻?yīng)。在弱還原劑(如氰基氫硼化鋰或鈉)存在下，采用適當(dāng)?shù)闹迦┗蛲ㄟ^(guò)氨基的還原烷基化反應(yīng)最方便地進(jìn)行單烷基化反應(yīng)。而二烷基化反應(yīng)則可于堿存在下，使用過(guò)量烷基鹵處理氨基來(lái)完成。
溶液法合成肽采用對(duì)酰胺鍵常用的方法進(jìn)行。一般是采用適當(dāng)?shù)呐己蟿鏝，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，并可于存在1-羥基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)這類(lèi)催化劑的情況下，將帶有游離羧基的被保護(hù)的t-Boc氨基酸偶聯(lián)到帶有游離氨基的被保護(hù)的氨基酸上。其它方法，例如活化酯、酐或酰鹵的形成，被保護(hù)的t-Boc氨基酸的游離羧基的形成，以及在有或沒(méi)有堿存在下，與被保護(hù)之氨基酸的游離氨基反應(yīng)也是適用的。例如，在無(wú)水溶劑(如二氯甲烷或四氫呋喃(THF))中，在堿(如N-甲基嗎啉、DMAP(二甲基氨基吡啶)或三烷基胺)存在下，用氯代甲酸異丁酯處理被保護(hù)的Boc-氨基酸或肽以形成“活化的酐”，隨后再將其與另一個(gè)經(jīng)保護(hù)的氨基酸或肽的游離胺反應(yīng)。按此方法形成的肽，可使用常規(guī)技術(shù)選擇性地除去氨基或羧基末端保護(hù)基，并采用相似方法再偶聯(lián)到其他肽或氨基酸上。肽合成完畢后，使用前面介紹的方法除去保護(hù)基，例如在鈀或鉑催化劑存在下氫化，于液氨、氫氟酸或堿中用鈉處理之。
去保護(hù)以后，假如最終的肽含有一個(gè)堿基團(tuán)，則可制備酸加成鹽。肽的酸加成鹽按標(biāo)準(zhǔn)方式，在適當(dāng)溶劑中，從其母體化合物和稍微過(guò)量的酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、醋酸、馬來(lái)酸、琥珀酸或甲磺酸)制備。醋酸鹽形式是特別有用的。如果最終的肽含有酸性基團(tuán)，則可制備陽(yáng)離子鹽。一般可用稍過(guò)量的堿試劑例如含適當(dāng)陽(yáng)離子的氫氧化物，碳酸鹽或醇鹽處理母體化合物。諸如Na+、K+、Ca++和NH+4這類(lèi)陽(yáng)離子即是適于藥用之鹽的典型陽(yáng)離子。特別優(yōu)選的是Na+和NH+4。
總的來(lái)說(shuō)，為了發(fā)揮刺激效果，本發(fā)明的肽可以以0.5ng-1mg(優(yōu)選5-500ng)的劑量給病人注射或以50ng-5mg(例如每天每70Kg體重0.01mg-1mg)的劑量給病人口服;假如采用輸注或類(lèi)似技術(shù)給藥，其劑量為每70Kg體重0.005ng-1mg，例如六天期間大約0.03ng，其原則是期望病人細(xì)胞外液中肽的濃度為10-15M-10-5M左右。
根據(jù)本發(fā)明的另一特征，本發(fā)明提供了含前面定義的式(Ⅰ)的一種或多種化合物，或者其生理學(xué)上相容的鹽作為活性成份并與藥用載體或賦形劑相結(jié)合的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可配成適于口服、滴鼻、非腸道或直腸給藥的劑型。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“藥用的”也包括本發(fā)明作為獸藥的應(yīng)用。這些肽可以制成膠囊、片劑或配成乳劑或糖漿供口服。加入適于藥用的固體或液體載體以提高組合物的穩(wěn)定性或有利于組合物制備。液態(tài)載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水和水。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體也包括諸如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯這類(lèi)緩釋物質(zhì)，可單加或其與石臘一起添加。固體載體的量可以有所變化，但較好每劑量單位約含20mg-1g。該藥物制劑可按照制藥常規(guī)技術(shù)制得、包括經(jīng)碾磨、混合、成粒和壓片等步驟制成片劑;或經(jīng)碾磨、混合及填充等工藝制成硬膠囊?？芍瞥珊环N或幾種活性成份的膠囊，例如將活性成份與惰性載體(例如乳糖或山梨醇)混合、將混合物填入明膠膠囊內(nèi)。當(dāng)使用液體載體時(shí)，可將制劑配成糖漿、酏劑、乳劑或水或非水懸浮劑。這類(lèi)液體制劑可直接口服或填入軟膠囊中口服。也可以使用器官特異性載體系統(tǒng)。
本發(fā)明肽或其衍生物的其他藥物組合物可以配制成凍干粉的溶液經(jīng)胃腸道外途徑給藥。可以在使用前加入適當(dāng)?shù)南♂寗┗蚱渌伤幱玫妮d體來(lái)再加工粉末。液體制劑一般是緩沖的、等滲的水溶液。適當(dāng)稀釋劑的典型例子是普通等滲鹽水、溶于水中的標(biāo)準(zhǔn)5%葡萄糖或緩沖乙酸鈉或乙酸銨溶液。這類(lèi)制劑特別適于非胃腸道給藥，但也可口服使用及裝入計(jì)數(shù)劑量的吸入器或噴霧器中供吸入用。加入諸如聚乙烯吡咯啉酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉這類(lèi)賦形劑也是適宜的。
為直腸給藥，可將磨碎的本發(fā)明肽粉末與諸如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇這類(lèi)賦形劑相結(jié)合制成栓劑。磨碎的粉末也可以與油制劑、膠、乳霜或乳劑混合，經(jīng)緩沖或不經(jīng)緩沖并通過(guò)透皮膏給藥。
可以用相似方法在水溶液中配制鼻噴霧劑，并裝入帶有氣霧推進(jìn)器或配有供手動(dòng)壓出配件的噴注容器中。
含本發(fā)明化合物的劑量單位最好含有0.1-100mg，例如含1-50mg式(Ⅰ)的肽或其鹽。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)特征，本發(fā)明提供了一種抑制骨髓組織生長(zhǎng)的方法，該方法包括給病人使用前面定義的有效量的藥物組合物。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用本發(fā)明化合物時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生不可接受的毒性作用。
通過(guò)下面的試驗(yàn)來(lái)證明式(Ⅰ)化合物的生物活性。
通過(guò)基質(zhì)(Stromal)細(xì)胞誘導(dǎo)集落刺激活性使人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系C6在塑料組織培養(yǎng)皿中，于RPMI-1640培養(yǎng)基和5%FBS中生長(zhǎng)至融合。試驗(yàn)前一天，將該培養(yǎng)基換成不加血清的DMEM。將化合物以一個(gè)小時(shí)的時(shí)間加到這些培養(yǎng)物中，然后從培養(yǎng)物中洗出。用新鮮DMEM代替培養(yǎng)基并于5%CO2，37℃下將細(xì)胞保溫24小時(shí)。24小時(shí)后收集C6細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、無(wú)菌過(guò)濾、并冷凍直至可以按下述方法檢測(cè)造血集落刺激活性(CSA)的存在。
軟瓊脂試驗(yàn)取路易士小鼠的骨髓細(xì)胞。在無(wú)血清DMEM中將其調(diào)到106個(gè)細(xì)胞/ml。所用的單層瓊脂系統(tǒng)是富集營(yíng)養(yǎng)素(NaHCO3，丙酮酸鹽，氨基酸，維生素和HEPES緩沖劑)的DMEM;0.3Bacto瓊脂和20%Lewis大鼠血清。向該培養(yǎng)基中加入大鼠骨髓細(xì)胞(最終濃度為105個(gè)細(xì)胞/毫升)及C6細(xì)胞系上層清液的稀釋液(10-2.5%)。該瓊脂板在37℃，5%CO2下保溫7到8天。用顯微鏡計(jì)數(shù)增殖的骨髓細(xì)胞(CFU-C)集落。計(jì)數(shù)出的瓊脂集落數(shù)與在C6骨髓基質(zhì)細(xì)胞系上清液內(nèi)存在之CSA的量成比例的。
單純皰疹小鼠模型感染前7天，給Balb/c小鼠每天一次腹腔內(nèi)注射0.2ml劑量為10和1ng/Kg的化合物。對(duì)照組小鼠則注射0.1ml的稀釋緩沖液，DPBS和0.5%熱失活的正常小鼠血清的混合物。
通過(guò)在小鼠每只后足掌中注入懸浮于0.05ml PBS內(nèi)的5.0×105pfu病毒用單純皰疹病毒(MS株)感染小鼠。直到瀕死之前(不給食物或水)連續(xù)給小鼠注射化合物或?qū)φ兆⑸湟?。通常在大約感染8天后出現(xiàn)后肢麻痹。癱瘓過(guò)程一直進(jìn)行到了發(fā)生腦炎為止。
另一種方法是通過(guò)陰道途徑接種病毒。把含有5.0×105/pfu MS-NAP病毒株的棉塞插入小鼠陰道內(nèi)。
使用Wilcoxin實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定是否被治療小鼠比對(duì)照組小鼠的存活率有顯著增加。
抗念珠菌攻擊使用白色念珠菌B311a菌株。該菌株已在小鼠體內(nèi)傳代，然后在-70℃下冷凍。B311a對(duì)免疫抑制小鼠在5.0到8.0×104cfu/小鼠范圍內(nèi)和正常小鼠在1.0到2.0×105cfu/小鼠范圍內(nèi)有毒力。使白色念珠菌冷凍材料中的樣品生長(zhǎng)于Sabouroud葡萄糖斜面上，然后轉(zhuǎn)移到50ml振蕩的Sabouroud肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)18小時(shí)。將細(xì)胞洗三次，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并用亞甲蘭染料排除法證實(shí)其存活性。對(duì)接種物進(jìn)行存活率計(jì)數(shù)以證實(shí)這一計(jì)數(shù)。
通過(guò)靜脈注射懸浮于0.2ml鹽水中的細(xì)胞用念珠菌感染所有小鼠(Balb/c)，經(jīng)用300拉德射線照射使一些小鼠發(fā)生亞致死性骨髓抑制。照射開(kāi)始后2小時(shí)，每天給動(dòng)物注射CSF化合物(作陽(yáng)性對(duì)照)或賦形劑。照射后7天開(kāi)始治療，通過(guò)靜脈給藥用白色念珠菌攻擊小鼠。這差不多代表了正常小鼠的LD75。在其他研究中小鼠沒(méi)有受到免疫抑制。在這些研究中，小鼠以與被照射小鼠相同方法感染后7天開(kāi)始治療。在這兩種模型中均觀察小鼠直到瀕死期為止，并用Wilcoxin實(shí)驗(yàn)比較存活率的變化。
下列實(shí)施例用來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例并不是限定本發(fā)明的范圍，而是舉例說(shuō)明如何制備和使用本發(fā)明的化合物。
在這些實(shí)施例中，所有的溫度均為攝氏度。在Dionex Autoion100上進(jìn)行氨基酸分析。肽含量分析是以氨基酸分析為基礎(chǔ)的。在VG ZAB質(zhì)譜儀上用快原子轟擊FAB質(zhì)譜分析。所使用的縮寫(xiě)字如下Arg＝精氨酸Asp＝天冬氨酸t(yī)-BOC＝叔丁氧基羰基Bz＝芐基Cl-Z＝對(duì)位氯芐氧羰基碳酰(Z＝芐氧羰基碳酰)
DCC＝二環(huán)己基碳化二亞胺DIEA＝二異丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺Glu＝谷氨酸p-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基己炔酸HOBT＝羥基苯并三唑Lys＝賴氨酸NMP＝N-甲基-2-吡咯烷酮Pro＝脯氨酸Gln＝谷氨酰胺Cys＝胱氨酸
N-MeArg＝N-甲基精氨酸Prc＝雙Boc-S，S′-1，3-丙二基胱氨酸Etc＝雙Boc-S，S′-1，2-乙二基胱氨酸Buc＝雙Boc-S，S′-1，4-丁二基胱氨酸Chc＝環(huán)己烷羧酸Tfc＝四氫-2-糠酸Otz＝2-氧代-4-噻唑烷Cpa＝環(huán)戊烷T(mén)pc＝3-噻吩羧酸S-Otf＝(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸R-Otf＝(R)-(-)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸Ppc＝2-哌啶酸Ser＝絲氨酸Nle＝正亮氨酸實(shí)施例1(Pic-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶1]a.Boc-Lys(Cl-Z)-樹(shù)脂的合成將Boc-Lys(Cl-Z)[16.6g，40mmol]溶解于150毫升含10%水的甲醇溶液中。用40ml 1M CsCO3溶液中和該溶液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮中和過(guò)的溶液。用DMF稀釋所得到的銫鹽并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去DMF。將該步驟重復(fù)兩次以上。將該鹽在真空中干燥4小時(shí)。
用120ml DMF稀釋Boc-Lys(Cl-Z)的銫鹽。向其中加入20g氯甲基樹(shù)脂(1meq/g)。在40℃下把反應(yīng)混合物旋動(dòng)48小時(shí)。
將樹(shù)脂冷卻到室溫并用熔結(jié)漏斗過(guò)濾之，然后按下列次序依次洗滌500ml DMF;500ml DMF∶H2O(1∶1);500ml DMF;500ml MeOH和1000ml CH2Cl2。把樹(shù)脂在真空中干燥?；厥账腂oc-Lys(Cl-Z)樹(shù)脂23.9g。
對(duì)所得樹(shù)脂進(jìn)行氨基酸分析。以氮(N)和氯(Cl)的測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ)，計(jì)算出樹(shù)脂上的取代為0.493meq/g。
b.Boc-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂的合成把23g(11.339mmol)的Boc-Lys(Cl-Z)-樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器內(nèi)并懸浮于CH2Cl2中。
用40ml在CH2Cl2中的50% TEA洗滌樹(shù)脂5分鐘，再用另外40ml50%TFA洗滌30分鐘以除去Boc-Lys(Cl-Z)樹(shù)脂的Boc保護(hù)。然后再用40ml CH2Cl2洗3次。
所得TFA鹽用40ml溶于CH2Cl2中的10%DIEA處理(1分鐘)兩次，用40ml CH2Cl2洗滌一次并用40ml在CH2Cl2中的10%DIEA洗滌一次以上。用CH2Cl2(6×40ml)徹底洗滌該樹(shù)脂。
為使N，N′-雙-Boc二氨基辛二酸(Boc-Sub-OH)與NH2-Lys(Cl-Z)-樹(shù)脂偶聯(lián)，將樹(shù)脂懸浮于加在手動(dòng)振搖容器內(nèi)的100ml二氯甲烷(CH2Cl2)中。在另一個(gè)50ml燒瓶中，將2.29g(5.66mmol)(Boc-Sub-OH)和HOBt(1.53g，11.34mmol)溶于5ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)和20mlCH2Cl2中。用冰浴將溶液冷卻到0℃。在所得溶液中加入DCC(2.34g，11.34mmol)并在0℃下將反應(yīng)混和物攪拌15分鐘。濾去所得到的二環(huán)己脲沉淀物，把預(yù)形成的活性酯加到NH2-Lys(2-Cl-Z)-樹(shù)脂懸浮液中。用Kaiser試驗(yàn)(茚三酮)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。96小時(shí)后，用CH2Cl2(3×40ml)、(3×40ml)和CH2Cl2(6×40ml)洗此二肽鍵-樹(shù)脂。處理后茚三酮試驗(yàn)得到一種與陰性對(duì)照差不多的淺藍(lán)色溶液。然后用溶在CH2Cl2中的10%乙酐將樹(shù)脂洗一次(10分鐘)，最后再用CH2Cl2(6×40ml)洗滌。
c.[Boc-Asp(OBz)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂的合成重復(fù)TFA去保護(hù)和中和步驟以制備與Boc-Asp(OBz)偶聯(lián)的雙肽鍵-樹(shù)脂。為偶聯(lián)該氨基酸，使用3.67g(11.339mmol)Boc-Asp(OBz)，2.34g(11.339mmol)和1.53gHOBt。陰性茚三酮試驗(yàn)指示24小時(shí)后完成了偶聯(lián)。該三肽-樹(shù)脂也被用來(lái)制取在2(B)位上有不同氨基酸的其他肽。
d.[Boc-Glu(OBz)-Asp(OBz)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂的合成將5g(2.465mmol)三肽-樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到一個(gè)較小的反應(yīng)容器中。如上面所描述的，重復(fù)TFA去保護(hù)步驟和DIEA中和步驟。為了偶聯(lián)，使用Boc-Glu(OBzl)[3.66g，10.846mmol]，HOBt[1.47g，10.846mmol]和DCC[2.23g，10.846mmol]。偶聯(lián)24小時(shí)后，反應(yīng)完成并回收到5.4g[Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂。偶聯(lián)是在60ml DMF/CH2Cl2中進(jìn)行的。用該四肽制取本發(fā)明化合物之1(A)位上有不同氨基酸的其他肽。
e.(Pic-Glu-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶1]的合成從[Boc-Glu(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂中除去Boc基團(tuán)，使用146mg(1.0846mmol)HOBt和223mg(1.0846mmol)DCC在DMF中偶聯(lián)132.8mg吡啶甲酸。
使肽去保護(hù)，并用液體HF/甲氧基苯(10ml HF和0.35ml甲氧基苯)在0℃下處理1小時(shí)從樹(shù)脂上裂開(kāi)之。在真空下除去HF，用乙醚洗滌肽/樹(shù)脂混和物，并用0.1%TFA/水溶液提取之。凍干該溶液。裂解350mg肽-樹(shù)脂后產(chǎn)生110mg粗肽。在C-18VYDAC制備柱上純化粗肽(50mg)，并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫后得到8毫克純肽。FAB MS(M+H1159.3)氨基酸分析Asp1.9(2)，Glu2.2(2)和Lys(2)(未分析Pic和Sub)HPLC純度＞95%實(shí)施例2(pGlu-Ser-Asp)2-Sub-(Lys)2[SEQ ID NO∶3]按實(shí)施例18中描述的方法合成[Boc-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂。從[Boc-Asp(OBzl)]2-Sub-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂(0.5克)上裂開(kāi)掉Boc基團(tuán)。用146mg(1.0846mmol)HOBt和223mg(1.0846mmol)DCC在DMF/CH2Cl2中偶聯(lián)318.96mg Boc-Ser(OBz)-OH(1.08mM)和139.45mg pGlu(1.08mM)。使肽去保護(hù)并用液態(tài)HF/甲氧基苯(10ml HF和0.35ml甲氧基苯)在0℃下處理1小時(shí)從樹(shù)脂上裂開(kāi)之。在真空下除去HF，用乙醚洗滌肽/樹(shù)脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取之。冷凍干燥該溶液。裂解350mg肽-樹(shù)脂產(chǎn)生125mg粗肽。在C-18VYDAC制備柱上純化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫之。獲得11毫克純肽。
FAB MS(M+H 1087.4)氨基酸分析Asp2.01(2)，Ser1.50(2)，Glu2.6(2)和Lys2(2)(沒(méi)有分析Sub，且因水解期間分解致使Ser值不正確)HPLC純度＞95%實(shí)施例3(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys)2[SEQ ID NO∶6]按實(shí)施例18(a)所述方法合成該肽的Boc-Lys(Cl-Z)-樹(shù)脂。除N，N′-雙-Boc·二氨基辛二酸(Boc-Sub-OH)用N，N′二-Boc二氨基己二酸(Boc-Adp-OH)取代外，使用如實(shí)施例18(b)和18(c)中所述的合成[Boc-Asp(OBz)]2-Adp-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂的相同方法。使用0.5克[Boc-Asp(OBz)]2-Adp-[Lys(Cl-Z)]2-樹(shù)脂合成(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys)2[SEQ ID NO∶6]。用Boc-Ser(Bz)-OH和吡啶甲酸重復(fù)去保護(hù)，中和及偶聯(lián)循環(huán)。偶聯(lián)中使用1.8mM氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)在10mlDMF/CH2Cl2中進(jìn)行。裂解400mg肽-樹(shù)脂，得到113mg粗肽，在C-18Vydac 制備柱上純化50mg粗肽并使用乙腈/水TFA緩沖系統(tǒng)洗脫，得到13毫克純肽。
FAB MS(M+H1047.4)氨基酸分析Asp2.00(2)，Ser1.62(2)，Lys1.81(2)(Pic和Adp沒(méi)有分析)HPLC純度＞95%實(shí)施例4(Pic-Ser-Asp)2-Adp-(Lys-CONH2)2[SEQ ID NO∶11]把5克Boc-Lys(Cl-Z)-BHA樹(shù)脂(2.15mM，取代值＝0.43meq/g，Applied Biosystem Inc.)裝入振蕩器內(nèi)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)和中和循環(huán)。使用974mg(4.3mM)DCC和638mg(4.3mM)HOBt偶聯(lián)N，N′-二Boc-二氨基己二酸(Boc-Adp-OH/404mg，1.075mM)。偶聯(lián)在N-甲基-吡咯烷酮(NMP)和二氯甲烷中進(jìn)行。72小時(shí)后用在CH2Cl2中的10%乙酐封住未反應(yīng)的氨基。去保護(hù)和中和之后，使用DCC1.95g(9.46mM)，HOBt 1.28g(9.46mM)在DMF/CH2Cl2使Boc-Asp(OBz)-OH3.1g(9.46mM)與樹(shù)脂偶聯(lián)。經(jīng)過(guò)下一次去保護(hù)和中和循環(huán)后，用二氯甲烷洗樹(shù)脂并干燥之。將0.5g該三肽樹(shù)脂裝入一個(gè)較小的手動(dòng)振搖容器內(nèi)，按實(shí)施例18中所描述的方法使其他兩種殘基(Boc-Ser(OBz)-OH和Pic)與樹(shù)脂相偶聯(lián)。用10mlHF和0.35ml苯甲醚裂解350mg肽樹(shù)脂。用乙醚洗肽/樹(shù)脂混和物并在0.1%TFA/水溶液中提取肽。冷凍干燥提取液得到大約120mg的粗肽。在C-18Vydac制備柱上使用TFA/乙腈/水緩沖液梯度洗脫純化50毫克粗肽。
ES MS(M+H1045.4)氨基酸分析Asp2.00(2)，Ser1.67(2)，Lys1.74(2)。
HPLC純度＞95%實(shí)施例5(pGlu-Glu-Asp)2-Adp-(Tyr-Lys)2∶[SEQ ID NO∶8]將1克(0.64mM)Boy-Lys(Cl-Z)-樹(shù)脂裝入一手動(dòng)振蕩容器內(nèi)。經(jīng)去保護(hù)和中和循環(huán)之后，用DCC2.01g(10mM)和HOBt1.53g(10mM)將樹(shù)脂與Boc-Tyr(Br-Z)-OH 4.9g(10mM)偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)在DMF/CH2Cl2中進(jìn)行。用Kaiser′s試驗(yàn)監(jiān)測(cè)偶聯(lián)完成情況。除去Boc基團(tuán)并中和后，使用DCC128.4mg(0.64mM)和HOBt98mg(0.64mM)在20ml DMF/CH2Cl2中偶聯(lián)N，N′-二-Boc-二氨基己二酸127.4mg(0.33mM)。用Kaiser′s試驗(yàn)監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)。72小時(shí)后(反應(yīng)還沒(méi)有完成)加入另外1毫摩爾DCC(201mg)和HOBt(153mg)。再過(guò)72小時(shí)之后，用加在二氯甲烷中的10%乙酐封住在未反應(yīng)的氨基基團(tuán)上。用標(biāo)準(zhǔn)的去保護(hù)、中和和偶聯(lián)循環(huán)偶聯(lián)其余的氨基酸。使用10毫摩爾各氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)是在DMF/CH2Cl2中進(jìn)行的。用30ml HF和1ml苯甲醚裂解整個(gè)肽樹(shù)脂。用乙醚洗肽/樹(shù)脂混和物并用0.1%TFA/水提取肽。冷冰干燥該提取液。在C-18制備柱上用TFA/乙腈/水緩沖梯度系統(tǒng)純化350mg粗肽。得到112mg純肽。
ES MS(M+H1470.8)氨基酸分析Asp 2.27(2)，Glu4.17(4)，Tyr1.74(2)和Lys2(2)(沒(méi)有分析Adp，Tyr的值，因水解期間分解測(cè)定不準(zhǔn)確)HPLC純度＞95%實(shí)施例6(pGlu-Glu-Lys)2-Sub-(Asp)2∶[SEQ ID NO∶12]將1克Boc-Asp(OcHex＊)PAM樹(shù)脂(Bachem CA.，0.5mM/g)裝入手動(dòng)力振蕩的容器內(nèi)。在去保護(hù)和中和循環(huán)后，用實(shí)施例18中所描述的方法將N，N′-二-Boc-二氨基辛二酸偶聯(lián)到樹(shù)脂上。用標(biāo)準(zhǔn)的去保護(hù)、中和和偶聯(lián)方法偶聯(lián)其余的三個(gè)氨基酸(Boc-Lys(Cl-Z)-OH，Boc-Glu(OBz)-OH和pGlu)。使用了3毫摩爾氨基酸，DCC和HOBt。偶聯(lián)是在DMF/CH2Cl2中進(jìn)行的。用10ml HF和1.0ml苯甲醚裂解肽樹(shù)脂。用乙醚洗肽/樹(shù)脂混和物并用0.1%TFA/水溶液提取肽。冷凍干燥該提取液得到大約4789mg粗肽。在C-18Vydac制備柱上使用TFA/乙腈/水緩沖梯度洗脫純化60mg粗肽。獲得19mg純肽。
＊環(huán)己基ES MS(M+H1171.4)氨基酸分析Asp1.98(2)，Glu4.56(2)，和Lys2(2)(沒(méi)有分析Sub)HPLC純度＞95%
實(shí)施例7-8按上面給出的方法制備下列化合物(Pic-Glu-Asp)2-Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶9](Pic-Glu-Asp)2-Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO∶10]實(shí)施例9(Pic-Ser-Ala)2-Sub(Nle-NH2)2[SEQ ID NO∶13]將Boc-Nle.DCHA(1.24g，3.0mM)，HOBt(0.46g，3.0mM)和PyBOP(1.56g，3.0mM)一起溶于10ml DMF中。加入DIEA(0.77ml，4.5mM)并攪拌混和物10分鐘。然后將活化的氨基酸裝入手動(dòng)振蕩容器內(nèi)，該容器中含有在5ml DMF中溶脹的1.61g(1.0mM)對(duì)位甲基二苯甲基胺樹(shù)脂。樹(shù)脂已預(yù)先用加在DMF中的5%DIEA(2×)處理過(guò)并用DMF(3×)洗過(guò)。將反應(yīng)容器振蕩1小時(shí)30分鐘Kaiser試驗(yàn)結(jié)果為陰性。用DMF(2×)，iPrOH/DCM(1/1)(2×)和DCM(2×)洗樹(shù)脂，用33%TFA的DCM溶液除去Boc基團(tuán)。用5%DIEA的DMF溶液中和后，在DMF/DCM(1/4)中用0.5mM(76.6mg)HOBt和0.5mM(78.6μl)DICC使0.25mM(101.0mg)的Boc-Sub與0.5mM Nle-樹(shù)脂偶聯(lián)。48小時(shí)后Kaiser試驗(yàn)稍顯陽(yáng)性;把另外的HOBt和DICC(各0.25mM)加入樹(shù)脂中。72小時(shí)后定量Kaiser試驗(yàn)表明偶聯(lián)得率為93%。用20%乙酐和在DMF中的5%DIEA溶液封住未反應(yīng)的氨基基團(tuán)。重復(fù)前述去保護(hù)、中和和偶聯(lián)循環(huán)以偶聯(lián)Boc-Ala，Boc-Ser(OBz)和Pic。其中使用加在10ml DMF中的1.5mM氨基酸、PyBOP和HOBt。在加入2.25mM DIEA后將氨基酸預(yù)活化10分鐘，然后將此混合物加入樹(shù)脂中。用Kaiser試驗(yàn)監(jiān)測(cè)偶聯(lián)完成情況，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果是陽(yáng)性，即重復(fù)偶聯(lián)步驟。使0.5g所得樹(shù)脂肽(總共獲得1.34g)去保護(hù)，并用1.0ml苯甲醚和10ml HF在-5℃下裂解1小時(shí)。蒸發(fā)掉HF，用乙醚洗肽樹(shù)脂混合物。用0.5%TFA水溶液，然后用冰醋酸提取肽。冷凍干燥后，得到57.7mg粗肽。用乙腈-水(0.1%TFA緩沖系統(tǒng))在C-18Vydac制備柱上純化粗肽(22.6mg)。得到3.5mg純肽。氨基酸分析和FAB-MS進(jìn)一步證實(shí)其結(jié)構(gòu)。
氨基酸分析Ser(2)，Ala(2)，Sub(1)，Nle(2)。
實(shí)施例10-11按上面給出的方法合成下列化合物(Pic-Ser-Ser)2-Sub(Gln-NH2)2[SEQ ID NO∶14](Pic-Ser-Phe)2-Sub(Phe-NH2)2[SEQ ID NO∶15]實(shí)施例12可按不同劑型并加入多種不同的賦形劑制備摻入了本發(fā)明化合物的藥用配制劑。下面給出這類(lèi)配方的例子片劑/每片成分1.活性成分(式Ⅰ的化合物) 0.5mg2.玉米淀粉 20mg3.藻酸 20mg4.藻酸鈉 20mg5.硬脂酸鎂 1.3mg
片劑制備方法步驟1在一個(gè)適當(dāng)?shù)幕旌推?攪拌器中混和成分No.1，No.2，No.3和No.4。
步驟2分批添加足量水到步驟1中的摻合物中，每次加入后都仔細(xì)混和之。加水并混和直到團(tuán)塊的稠度可以轉(zhuǎn)化為濕顆粒為止。
步驟3使?jié)駡F(tuán)塊通過(guò)一個(gè)No.8篩目(2.38mm)篩的搖擺式造粒機(jī)使之成為顆粒。
步驟4然后在干燥箱內(nèi)于140°F(60℃)下烘干濕顆粒，直到干燥為止。
步驟5用成分No.5潤(rùn)滑干顆粒。
步驟6用一臺(tái)合適的壓片機(jī)榨壓潤(rùn)滑過(guò)的顆粒。
胃腸道外給藥的制劑制備胃腸道外給藥的藥物組合物，即將適量的式Ⅰ化合物加熱溶入聚乙二醇中。然后用注射用水Ph Eur.稀釋該溶液(至100ml)。再通過(guò)0.22微米膜濾器過(guò)濾除菌并在無(wú)菌容器中密封之。
權(quán)利要求
1.由下式代表的化合物或其醫(yī)學(xué)上可接受的鹽
其中Y1和Y2分別是CH2或S；x是0，1，2，3或4；m是0，1或2；n是0，1或2；A是2-噻吩羧酸、吡啶甲酸、環(huán)己烷羧酸、四氫-2-糠酸、四氫-3-糠酸、2-氧代-4-噻唑烷羧酸、環(huán)戊烷羧酸、3-噻吩羧酸、(S)-(+)-5-氧代-2-四氫呋喃羧酸、2-哌啶酸、吡咯羧酸、異吡咯羧酸、吡唑羧酸、異咪唑羧酸、三唑羧酸、二硫雜環(huán)戊二烯羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、異噁唑羧酸、噁唑羧酸、噻唑羧酸、異噻唑羧酸、噁二唑羧酸、噁三唑羧酸、氧硫雜環(huán)戊二烯羧酸、噁嗪羧酸、噁噻唑羧酸、二噁唑羧酸、吡喃羧酸、嘧啶羧酸、吡啶羧酸、噠嗪羧酸、吡嗪羧酸、哌嗪羧酸、三嗪羧酸、異噁嗪羧酸、氧硫氮雜烯羧酸或嗎啉羧酸、吲哚羧酸、吲哚恩羧酸(indolenenecarboxylic acid)、2-異吲哚羧酸、1，5-吡啶羧酸、吡喃并[3，4-b]吡咯羧酸、異吲哚羧酸、吲噁嗪羧酸(indoxazinecarboxylic acid)、苯并噁唑羧酸、苯鄰甲內(nèi)酰胺羧酸、喹啉羧酸、異喹啉羧酸、噌啉羧酸、喹唑啉羧酸、1，5-二氮雜萘羧酸、吡啶并[3，4-b]吡啶羧酸、吡啶并[3，2-b]吡啶羧酸、吡啶并[4，3-b]吡啶羧酸、1，3，2-苯并噁嗪羧酸、1，4，2-苯并噁嗪羧酸、2，3，1-苯并噁嗪羧酸、3，1，4-苯并噁嗪羧酸、1，2-苯并異噁嗪羧酸、1，4-苯并異噁嗪羧酸、咔唑羧酸、噁啶羧酸或嘌呤羧酸；B是絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸；D是賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、N-甲基精氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸、絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸、b-丙氨酸、肌氨酸，或二氨己炔酸；或羧酰胺，或其羥甲基衍生物；E是谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或肽鍵；F是酪氨酸或肽鍵；或者其中Y1，Y2，x，m，n，C，D，F(xiàn)是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、或谷氨酸，而B(niǎo)是絲氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m，n，D和F是如上所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；而C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m，n和F是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或纈氨酸；而D是鳥(niǎo)氨酸；或者其中Y1，Y2，x，m和n是如上文所定義的；A是焦谷氨酸、脯氨酸、谷氨酸酰胺、酪氨酸或谷氨酸；B是谷氨酸、酪氨酸或天冬氨酸；C是絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸；D是鳥(niǎo)氨酸，而F是酪氨酸；所有上述這些定義的條件是·當(dāng)Y1和Y2是S時(shí)，x是2，3或4，且m和n是1；或·當(dāng)Y1和Y2是CH2時(shí)，x是0，1或2，且m和n是0；或·當(dāng)Y1是S和Y2是CH2時(shí)，x是0且n是1；或·當(dāng)Y2是S和Y1是CH2時(shí)，x是0且m是1；·如果C選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酸酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸時(shí)，則D就選自于絲氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸、正亮氨酸、別蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸或肌氨酸。
2.權(quán)利要求1中所述的化合物，其中Y1和Y2是CH2，x是0或2，A是焦谷氨酸，吡啶羧酸，脯氨酸，酪氨酸，或2-哌啶甲酸;B是谷氨酸，絲氨酸，天冬氨酸或酪氨酸;C是天冬氨酸，谷氨酸，酪氨酸或賴氨酸;D是賴氨酸，其羧酰胺衍生物，精氨酸，N-甲基精氨酸，2，6-二氨基-4-己炔酸，天冬氨酸或鳥(niǎo)氨酸且E是肽鍵。
3.權(quán)利要求1所述的化合物選自于(Pic-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶1](L-Ppc-Glu-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶2](pGlu-Ser-Asp)2Sub(Lys)2[SEQ ID NO∶3](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶4](pGlu-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2[SEQ ID NO∶5](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys)2[SEQ ID NO∶6](Pic-Ser-Asp)2Adp(Lys-NH2)2or [SEQ ID NO∶7](pGlu-Glu-Asp)2-Adp(Typ-Lys)2SEQ ID NO∶8]
4.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1到3中所述的任何一種化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
5.一種刺激骨髓生成系統(tǒng)的方法，包括給需要治療者服用刺激該骨髓生長(zhǎng)系統(tǒng)有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的化合物。
6.一種預(yù)防或治療病毒、真菌和細(xì)菌感染的方法，包括給需要治療者服用有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的化合物。
7.一種預(yù)防或治療念珠菌、皰疹或肝炎感染的方法，包括給需要治療者服用有效劑量的權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的化合物。
8.一種制備如權(quán)利要求1所定義的式(Ⅰ)化合物的方法，包括，a)偶聯(lián)被保護(hù)的氨基酸形成適宜當(dāng)被保護(hù)的下列結(jié)構(gòu)通式的化合物
其中Y1，Y2，m，n，A，B，C和E為如權(quán)利要求1所定義的;[D′]是氯代甲基，甲基二苯甲基胺，二苯甲基胺或苯乙酰胺基甲基樹(shù)脂或D是如權(quán)利要求1中所定義的;b)除去任何保護(hù)基團(tuán)，必要時(shí)，從樹(shù)脂上裂解掉肽;并且c)根據(jù)需要形成其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供如下通式的化合物該化合物具有血調(diào)節(jié)活性，可用于刺激造血機(jī)能以及預(yù)防和治療病毒、真菌和細(xì)菌感染性疾病。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1077960SQ9310206
公開(kāi)日1993年11月3日 申請(qǐng)日期1993年1月8日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月10日
發(fā)明者P·K·巴納加, W·F·哈夫曼 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司