專利名稱：五環(huán)三萜類化合物在制備糖原磷酸化酶抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及五環(huán)三萜類化合物在制備糖原磷酸化酶抑制劑中的應用，包括制備抗糖尿病藥物上的應用。
背景技術：
糖原是體內糖的貯存形式，主要存在于肌肉和肝臟中。肌糖原降解可為肌肉自身收縮供給能量，肝糖原降解主要維持血糖濃度。
糖原的降解涉及糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)。該酶催化糖原的磷酸解，產生的葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶催化下轉變成葡萄糖-6-磷酸，后者或是進入糖酵解反應，或是在葡萄糖-6-磷酸酶催化下生成葡萄糖，進入血液，為其它組織提供葡萄糖。由于糖原磷酸化酶是與糖代謝相關的能量代謝中的一個非常重要的因子，因此，對它的藥理性抑制有可能用于治療與糖原代謝異常(糖原過度降解)相關的病變，如糖尿病、心肌缺血損傷和腫瘤等。
糖尿病已成為嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其病理因素有很多，如肥胖所導致的胰島素抵抗等。糖尿病患者的肝臟葡萄糖生成的顯著增加是導致高血糖的另一個重要原因，尤其是對于那些由于焦慮和不良生活習慣(抽煙、酗酒等)所引起的高血糖癥患者和禁食后高血糖癥病人。因此，抑制肝臟葡萄糖生成已成為研制新型抗糖尿病藥物的重要靶標之一(Kurukulasuriya，R.et.al.Current Medicinal Chemistry，2003，10，99)。目前，在臨床上使用的能夠抑制肝臟葡萄糖生成的藥物非常有限。對糖尿病實驗動物模型的研究表明，通過抑制肝臟糖原磷酸化酶，可有效地抑制肝臟糖原的過度降解，從而降低了肝臟葡萄糖生成以達到降低血糖功效。糖原磷酸化酶抑制劑用于治療2型糖尿病已受到了廣泛關注(Somsak，L.et.al.Current Pharmaceutical Design，2003，9，1177)。輝瑞和默克等制藥公司已展開了對此類藥物的研發(fā)工作，其中輝瑞公司的研發(fā)藥物(CP-368296)已進入了II期臨床用以治療2型糖尿病，但該藥的缺點如選擇性差且生物利用度低等，限制了其在臨床上的應用。
已報道的糖原磷酸化酶抑制劑包括葡萄糖衍生物(Somsak等，Current PharmaceuticalDesign，2003，9，1177-1189)、咖啡因及其它嘌呤衍生物(Kasvinsky等，Journal ofBiological Chemistry，1978，2533343-3351和9102-9106)、二氫吡啶衍生物BAY-R3401(Bergans等，Diabetes，2000，491419-1426)、羥基吡咯烷衍生物DAB(Mackay等，Diabetes，Obesity and Metabolism，2003，5397-407)、芳香二羧酸衍生物(Lu等，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2003，134125-4128)和吲哚酰胺衍生物CP-368296(國際專利申請WO 96/39384)等。有關糖原磷酸化酶抑制劑的專利申請還包括WO 00/123347、WO 95/24391、WO 97/09040、WO 98/40353、WO 98/50359和WO 97/37901等。
五環(huán)三萜類化合物在植物界中的分布極為廣泛，是許多中草藥的主要有效成分。五環(huán)三萜類化合物按烷烴結構骨架的不同主要可分為齊墩果烷型、熊果烷型和羽扇豆烷型等。迄今為止，發(fā)明人尚未見任何關于五環(huán)三萜類化合物具有糖原磷酸化酶抑制活性的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是研究五環(huán)三萜類化合物作為新型的糖原磷酸化酶抑制劑；尤其是研究五環(huán)三萜類糖原磷酸化酶抑制劑在制備抗糖尿病藥物上的應用。
為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術方案。
下述式I和式II所示的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應用， 式I中，R1代表氫或羥基；R2代表氫、1～10個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；R3和R4分別代表氫或甲基，并且R3和R4不同時為氫；式II中，R5代表CH3、CH2OH、COOR6，這里R6代表氫、1～10個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
所述五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，式I中優(yōu)選，R2代表氫、1～6個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；式II中優(yōu)選，R6代表氫、1～6個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
式I中更優(yōu)選，R2代表甲基、乙基、異丙基；式II中更優(yōu)選，R6代表甲基、乙基、異丙基。
前述五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，其中式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們藥學上可接受的鹽或酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及它們藥學上可接受的鹽或酯。其中優(yōu)選式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們的甲酯、乙酯或芐酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及白樺脂酸的甲酯、乙酯或芐酯。
所述五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應用，包括在制備抗糖尿病藥物上的應用。
一種具有糖原磷酸化酶抑制作用的藥物組合物，含有前述五環(huán)三萜類化合物及其鹽或酯和藥學上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物中，五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學上可接受的鹽或酯。所述五環(huán)三萜類化合物可優(yōu)選山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學上可接受的甲酯、乙酯或芐酯。
本發(fā)明的藥物組合物，其抑制糖原磷酸化酶作用包括抗糖尿病作用。
上述五環(huán)三萜化合物的制備方法包括植物化學提取方法和半合成制備方法，并且，某些天然的五環(huán)三萜化合物已經有大量的商品化供應。例如，山楂酸主要存在于紅棗、油橄欖、山楂、石榴和鼠尾草中，國際專利申請WO 02/12159和WO 98/04331報道了從油橄欖中提取山楂酸的方法?？屏_索酸分布于大花紫薇(巴拿巴)、夏枯草、枇杷葉、沙棘葉、粗葉懸鉤子、紫蘇葉、番木瓜和厚皮香等植物中，美國專利申請US 2003/0165581報道了從夏枯草中提取制備科羅索酸的方法。本申請發(fā)明人的中國專利申請200410064929.7則采用如下反應示意式1所示路線半合成制備了山楂酸、科羅索酸及其相關衍生物。
反應示意式1 1b R3＝H，R4＝CH32b R3＝H，R4＝CH3 3a R3＝CH3，R4＝H科羅索酸R3＝CH3，R4＝H3b R3＝H，R4＝CH3山楂酸 R3＝H，R4＝CH3白樺脂醇在白樺樹的外皮中的含量非常高，可高達白樺樹外皮干重的20-30％。如反應示意式2所示，本申請發(fā)明人把從白樺樹外皮中提取的白樺脂醇經兩步反應轉化為白樺脂酸(Kim等，Synthetic Communication，1997，271607-1612)。
反應示意式2 齊墩果酸主要存在于女貞子、甜菜、楤木、木瓜等中草藥中，目前臨床上所用的齊墩果酸即是由女貞子中提取的，有商品化大量供應(供應廠商包括成都超人植化開發(fā)有限公司、云南云藥實驗室有限公司、昆明同持醫(yī)藥研究有限公司、陜西省太白青峰公司天然植物藥提取廠和云南玉溪萬方天然藥物有限公司等)，且價格低廉。熊果酸存在于女貞子和山茱萸等植物中，可通過植物化學提取獲得，并有商品化大量供應(供應廠商包括云南云藥實驗室有限公司、陜西慧科植物開發(fā)有限公司和陜西新生植物開發(fā)有限公司等)。
除了上述化合物外，如通式I和II所示的其它五環(huán)三萜化合物可參照文獻方法(Honda等，Journal of Natural Product，1997，601174-1177；Lee等，Journal of Natural Product，1998，611343-1347)制備。
本發(fā)明對一系列天然的和合成的五環(huán)三萜化合物進行了糖原磷酸化酶抑制活性的高通量篩選實驗，結果首次發(fā)現(xiàn)了一些五環(huán)三萜化合物對糖原磷酸化酶具有顯著的抑制作用。本發(fā)明進一步對部分五環(huán)三萜化合物進行了糖尿病小鼠降血糖活性實驗，結果表明，所試化合物對腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠具有顯著的抑制血糖升高活性。
具體實施例方式
五環(huán)三萜類化合物的制備試劑及測試方法紅外光譜用NieoletImpact 410型IR光譜儀測定，KBr壓片；1HNMR和13CNMR用ACF-300(500)BRUK型核磁共振儀測定；MS用HP1100型質譜儀測定。熊果酸(純度約95％)購于陜西慧科植物開發(fā)有限公司；齊墩果酸(純度約97％)購于成都超人植化開發(fā)有限公司；白樺樹外皮采自內蒙古；其它試劑和溶劑均為市售化學純或分析純產品，除特別說明外，未經處理直接使用。
實施例1山楂酸及其芐酯的制備齊墩果酸(10.0g)懸浮于100mL無水DMF中，于100℃加熱使完全溶解，靜置稍冷后加入K2CO3(6.04g)和氯芐(3.0mL)。此混和物于100℃加熱并攪拌直至原料消失(約需3小時)。冷卻后抽濾，固體以DMF洗滌3次，每次15mL。母液倒入500mL水中，邊倒邊搖使析出的固體分散，靜置待固體完全析出后，抽濾收集固體，以水充分洗滌。干燥后得白色的齊墩果酸芐酯粗產物11.51g(粗產率96％)。該粗產物可直接用于下一步反應。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.62，0.78，0.88，0.90，0.92，0.98，1.13(each，3H，s)，2.91(1H，dd，J＝4.4，13.9Hz，H-18)，3.20(1H，dd，J＝4.5，11.2Hz，H-3α)，5.07(2H，dd，J＝12.5，22.4Hz，CH2-Ar)，5.28(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.33(5H，m，H-Ar).
將上述齊墩果酸芐酯(10.0g)溶解于60ml無水CH2Cl2中，于冰水浴冷卻下加入PCC(6.8g)。冰水浴冷卻下攪拌，放熱趨緩后撤去冰水浴，室溫攪拌過夜。此深褐色物通過硅藻土過濾，漏斗中殘留物以CH2Cl2充分洗滌。母液蒸去溶劑后得棕黃色固體。以乙醇重結晶得白色固體9.1g(收率91.0％)。3-羰基齊墩果酸芐酯1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.62，0.90，0.92，1.01，1.04，1.08，1.13(each，3H，s)，2.36 and 2.51(2H，m，H-2)，2.92(1H，dd，J＝4.3，13.8Hz，H-18)，5.07(2H，dd，J＝12.5，21.6Hz，CH2-Ar)，5.30(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.33(5H，m，H-Ar).
將上述3-羰基齊墩果酸芐酯(4.0g)溶于80mL醋酸異丙烯酯中，小心加入約0.5mL濃硫酸，加熱回流12小時。冷卻后，向此溶液中小心加入固體NaHCO3直至無氣泡產生，過濾，濾液經濃縮蒸除過量的醋酸異丙烯酯，殘留物以乙醇重結晶得2-烯-3-乙酰氧基齊墩果酸芐酯3.81g(收率88％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.66，0.91，0.92，0.93，1.00，1.02，1.13(each，3H，s，)，2.15(3H，s，CH3C＝O)，2.93(1H，dd，J＝4.3，13.7Hz，H-18)，5.08(2H，dd，J＝12.5，23.5Hz，CH2-Ar)，5.15(1H，dd，J＝1.9，6.6Hz，H-2)，5.33(1H，t，J＝3.6Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述2-烯-3-乙酰氧基齊墩果酸芐酯(2.81g)以50mL絕對無水四氫呋喃溶解，以冰水浴冷卻，在氮氣保護下30分鐘內滴加40mL硼烷四氫呋喃溶液(1.0M)。冰水浴冷卻下反應3小時，再于室溫下攪拌過夜。冰水浴冷卻下向此溶液中小心滴加10％NaOH水溶液40mL，攪拌10分鐘后在冰水浴冷卻下加入30％H2O2溶液30mL，此乳濁液于冰水浴冷卻下攪拌30分鐘后再于室溫下攪拌直至無氣體產生。此乳濁液中加入100mL乙酸乙酯，劇烈攪拌后過濾，從濾液中分出乙酸乙酯層，水層再以乙酸乙酯萃取3次，每次50mL。合并的有機層以無水Na2SO4干燥，蒸去有機溶劑后得淡黃色固體。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1→5∶1→2∶1)得白色粉未狀山楂酸芐酯1.1g(41％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.60，0.82，0.90，0.92，0.95，1.02，1.12(each，3H，s)，2.91(1H，dd，J＝4.1，13.8Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.67(1H，ddd，J＝4.5，9.6，11.2Hz，H-2β)，5.07(2H，dd，J＝12.6，16.7Hz，CH2-Ar)，5.29(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.35(5H，m，H-Ar).
向上述山楂酸芐酯(1.06g)中加入10mL四氫呋喃，加10％Pd/C(0.15g)，室溫常壓氫化過夜，原料反應完全后，以四氫呋喃稀釋反應物，過濾除去Pd/C，濾液蒸去溶劑后得粉狀固體，加入適量正己烷將少量附著的顏色除去，過濾后得白色粉未狀純品山楂酸0.77g(產率87％)。mp 269-271℃。IR(KBr，cm-1)3414，2943，1695，1460，1051.1HNMR(pyridine-d5，300MHz)δ0.93，0.98，0.99，1.01，1.06，1.25，1.26(each，3H，s)，3.28(1H，dd，J＝3.9，13.6Hz，H-18)，3.37(1H，d，J＝9.3Hz，H-3α)，4.07(1H，ddd，J＝4.2，9.3，11.0Hz，H-2β)，5.46(1H，brs，H-18).13CNMR(pyridine-d5，300MHz)δ16.9(C-24)，17.5(C-25)，17.7(C-26)，18.9(C-6)，23.7(C-16)，23.8(C-30)，23.9(C-30)，26.2(C-27)，28.3(C-15)，29.3(C-23)，31.0(C-20)，33.2(C-7)，33.3(2C，C-22，C-29)，34.3(C-21)，38.5(C-10)，39.8(C-4)，42.0(C-19)，42.2(C-14)，46.7(C-17)，47.8(C-1)，48.2(2C，C-8，C-9)，55.9(C-5)，68.6(C-2)，83.8(C-3)，122.5(C-12)，144.9(C-13)，180.2(C-28)．上述光譜數(shù)據與文獻值一致(Taniguchi等，Phytochemistry，2002，59，315-323；鞠建華等，中國藥學雜志，2003年，38，752)。
實施例2熊果酸芐酯、科羅索酸及其芐酯的制備熊果酸(10.0g)懸浮于100mL無水DMF中，于100℃加熱使完全溶解，靜置稍冷后加入K2CO3(6.04g)和芐基氯(3.0mL)。此混和物于100℃加熱并攪拌直至原料消失(約需3小時)。冷卻后抽濾，固體以DMF洗滌3次，每次15mL。母液倒入500mL水中，邊倒邊搖使析出的固體分散，靜置待固體完全析出后，抽濾收集固體，以水充分洗滌。干燥后得白色的熊果酸芐酯粗產物11.54g(粗產率96.4％)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ0.67，0.81，0.92，0.97，1.01，1.10(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.4Hz)，2.30(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.24(1H，dd，J＝4.6，10.8Hz，H-3α)，5.09(2H，dd，J＝12.5，37.9Hz，CH2-Ar)，5.26(1H，t，J＝3.4Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述熊果酸芐酯粗產品(10.0g)溶解于65ml無水CH2Cl2中，于冰水浴冷卻下加入吡啶氯鉻酸鹽(PCC)(6.7g)。冰水浴冷卻下攪拌，放熱趨緩后撤去冰水浴，室溫攪拌過夜。此深褐色物通過硅藻土過濾，漏斗中殘留物以CH2Cl2充分洗滌。母液蒸去溶劑后得棕黃色固體。以乙醇重結晶得3-羰基熊果酸芐酯白色固體8.96g(收率90％)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δ0.71，0.97，1.05，1.07(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.4Hz)，1.11(6H，s)，2.31(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，2.55(2H，m，H-2)，5.08(2H，dd，J＝12.5，37.3Hz，CH2-Ar)，5.28(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.36(5H，m，H-Ar).
將上述3-羰基熊果酸芐酯(4.0g)溶于80mL醋酸異丙烯酯中，小心加入約0.5mL濃硫酸，加熱回流10小時。冷卻后，向此溶液中小心加入固體NaHCO3直至無氣泡產生，過濾，蒸除過量的醋酸乙烯酯，殘留物經柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1→20∶1)分離得2-烯-3-乙酰氧基熊果酸芐酯無色油狀物3.9g(產率90.5％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.68，0.91，1.007，1.015，1.08(each，3H，s)，0.86(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，0.93(3H，d，J＝6.3Hz，H-29)，2.14(3H，s，CH3C＝O)，2.28(1H，d，J＝11.2Hz，H-18)，5.04(2H，dd，J＝12.4，6.28Hz，CH2-Ar)，5.1 5(1H，dd，J＝1.8，6.5Hz，H-2)，5.26(1H，t，J＝3.5Hz，H-12)，7.34(5H，m，H-Ar).13CNMR(CDCl3，500MHz)δ15.6，16.8，16.9，19.3，19.5，21.0，21.1，23.2，23.3，24.2，27.89，27.93，30.7，32.4，36.1，36.6，37.4，38.8，39.1，39.4，39.8，42.1，45.9，48.1，52.6，53.0，65.9，112.0，125.7，136.3，137.9，152.1，169.7，177.2.
將上述2-烯-3-乙酰氧基熊果酸芐酯(3.9g)溶于10mL絕對無水四氫呋喃，以冰水浴冷卻，在氮氣保護下30分鐘內滴加40mL硼烷四氫呋喃溶液(1.0M)。冰水浴冷卻下反應3小時，再于室溫下攪拌過夜。冰水浴冷卻下小心滴加10％NaOH水溶液40mL，攪拌10分鐘后在冰水浴冷卻下加入30％H2O2溶液30mL，此乳濁液于冰水浴冷卻下攪拌30分鐘后再于室溫下攪拌2小時。向此乳濁液中加入100mL乙酸乙酯，劇烈攪拌后過濾，從濾液中分出乙酸乙酯層，水層再以乙酸乙酯萃取3次，每次50mL。合并的有機層以無水Na2SO4干燥，蒸去有機溶劑后得無色油狀物約4.5g。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1→2∶1)得科羅索酸芐酯1.5g(產率40％)。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.63，0.81，0.96，1.03，1.07(each，3H，s，H-23 to H-27)，0.85(3H，d，J＝6.4Hz，H-30)，0.94(3H，d，J＝6.3Hz，H-29)，2.27(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.4Hz，H-3α)，3.69(1H，ddd，J＝4.3，9.4，11.0Hz，H-2β)，5.04(2H，dd，J＝12.5，57.2Hz，CH2-Ar)，5.24(1H，t，J＝3.3Hz，H-12)，7.35(5H，m，H-Ar).13CNMR(CDCl3，500MHz)16.7，16.8，16.9，17.0，18.3，21.1，23.3，23.6，24.2，27.9，28.6，30.6，32.9，36.6，38.2，38.8，39.07，39.1，39.6，42.1，46.6，47.5，48.1，52.8，55.3，66.0，69.0，83.9 125.5，136.3，138.2，177.3.
將上述科羅索酸芐酯(1.16g)溶于50mL四氫呋喃，加10％Pd/C(0.2g)，室溫常壓氫化過夜，原料反應完全后，以四氫呋喃稀釋反應物，過濾除去Pd/C，濾液蒸去溶劑后得粉狀固體，加入適量正己烷將少量附著的顏色除去，過濾后得白色粉未狀科羅索酸0.95g(97.6％)。mp 253-255℃；文獻值mp 251-254℃(鞠建華等，中國藥學雜志，2003年，38，752)。IR(KBr，cm-1)3414，2945，1695，1456，1049.1HNMR(pyridine-d5，300MHz)δ0.94(3H，s，H-29)，0.96(3H，s，H-30)，0.97(3H，s，H-25)，1.02(3H，s，H-24)，1.05(3H，s，H-26)，1.19(3H，s，H-27)，1.25(3H，s，H-23)，2.60(1H，d，J＝11.3Hz，H-18)，3.36(1H，d，J＝9.4Hz，H-3α)，4.06(1H，ddd，J＝4.3，9.4，11.1Hz，H-2 β)，5.44(1H，t，J＝3.3Hz，H-12).13CNMR(pyridine-d5，300MHz)δ17.0(C-25)，17.5(2C，C-26，C-30)，17.7(C-24)，18.9(C-6)，21.4(C-29)，23.8(C-11)，23.9(C-27)，24.9(C-16)，28.7(C-15)，29.4(C-23)，31.1(C-21)，33.5(C-7)，37.5(C-22)，38.5(C-10)，39.4(C-19)，39.5(C-20)，39.8(C-4)，40.1(C-8)，42.6(C-14)，48.0(C-1)，48.1(C-17)，53.6(C-18)，60.0(C-5)，68.6(C-2)，83.8(C-3)，125.5(C-12)，139.3(C-13)，179.9(C-28).上述光譜數(shù)據與文獻值一致(Taniguchi等，Phytochemistry，2002，59，315-323；鞠建華等，中國藥學雜志，2003年，38，752)。
實施例3齊墩果酸甲酯的制備齊墩果酸(5.0g)溶解于50mL無水DMF中，加入K2CO3(3.0g)和MeI(0.82mL)，室溫攪拌2.5小時。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1mol/L鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得齊墩果酸甲酯的淡黃色粗品5.36g。取0.25g粗品經硅膠柱層析(洗脫劑，石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1)得純的齊墩果酸甲酯0.23g。1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.75，0.80，0.92，0.93，0.95，1.01，1.15(each，3H，s，)，2.88(1H，dd，J＝4.3，11.8Hz，H-18)，3.23(1H，m，H-3)，3.64(3H，s，-COOCH3)，5.30(1H，t，J＝3.5Hz，H-12).
實施例4熊果酸甲酯的制備熊果酸(1.0g)懸浮于10mL無水DMF中，加入K2CO3(0.6g)和MeI(0.15mL)，室溫攪拌4小時。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得熊果酸甲酯的白色粗品1.06g.取0.13g粗品經硅膠柱層析(洗脫劑，石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1)得純的熊果酸甲酯0.12g．1HNMR(CD Cl3，500MHz)δ0.75，0.80，0.93，1.00，1.08(each，3H，s)，0.87(3H，d，J＝6.5Hz)，0.95(3H，d，J＝6.2Hz)，2.24(1H，d，J＝10.5Hz，H-18)，3.22(1H，dd，J＝5.0，11.1Hz，H-3α)，3.61(3H，s，-COOCH3)，5.25(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實施例5科羅索酸甲酯的制備科羅索酸(0.2g)懸浮于5mL無水DMF中，加入K2CO3(0.2g)和MeI(0.1mL)，室溫攪拌4小時。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得科羅索酸甲酯的粗品。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1→3∶1)得科羅索酸甲酯白色固體0.18g.1HNMR(CDCl3，500MHz)δ0.77，0.85，1.02，1.06，1.10(each，3H，s)，0.88(3H，d，J＝6.5Hz，H-30)，0.96(3H，d，J＝6.1Hz，H-29)，2.26(1H，d，J＝11.2Hz，H-18)，3.02(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.62(3H，s，-COOCH3)，3.72(1H，ddd，J＝4.5，9.5，11.0Hz，H-2β)，5.27(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實施例6山楂酸甲酯的制備山楂酸(0.25g)懸浮于5mL無水DMF中，加入K2CO3(0.25g)和MeI(0.15mL)，室溫攪拌5小時。加水稀釋后，以乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯層依次以1％鹽酸水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌后，以無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑后得山楂酸甲酯的粗品。硅膠柱層析(梯度洗脫，石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1→3∶1)得山楂酸甲酯白色固體0.21g.1HNMR(CDCl3，500MHz)0.74，0.85，0.92，0.95，1.00，1.05，1.15(each，3H，s)，2.89(1H，dd，J＝4.4，14.0Hz，H-18)，3.00(1H，d，J＝9.5Hz，H-3α)，3.64(3H，s，-COOCH3)，3.71(1H，ddd，J＝4.4，9.5，11.1Hz，H-2β)，5.27(1H，t，J＝3.6Hz，H-12).
實施例7糖原磷酸化酶抑制活性的篩選實驗測試原理糖原在細胞內的分解，是由糖原磷酸化酶(GPa)來實現(xiàn)的。此酶作用于糖原的非還原端，可將一個葡萄糖殘基分解下來，并將它轉移到無機磷酸鹽上去。于是在長鏈縮短的同時，生成G-1-P，同時游離出新的末端，使磷酸化酶又可以起作用。此反應為可逆反應。在逆反應中，即糖原合成方向上，G-1-P作為底物，每加入糖原中一個葡萄糖會釋放一個磷酸根，在酸性條件下，磷酸根與鉬酸銨和孔雀綠的混合液發(fā)生反應，通過測定溶液反應顏色的變化，反映磷酸根的釋放量，從而間接反映磷酸化酶的活性。
儀器與試劑酶標儀(美國BIO-RAD公司)；數(shù)顯示水浴鍋(國華電器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司)；臺式離心機(上海手術器械廠)；高壓滅菌鍋(上海醫(yī)用核子儀器廠)；752分光光度計；96孔板(美國COSTAR公司)；rabbit肌糖原磷酸化酶(GPa)、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)、糖原(Glycogen)、孔雀綠(美國SIGMA公司)；咖啡因(caffeine)(上海試劑二廠)；Hepes、EGTA、EDTA(南京生興生物技術有限公司)；四水合鉬酸銨(合肥工業(yè)大學化學試劑廠)；Glycylglycine(美國Amersco公司)；NaF(上?；瘜W試劑有限公司)。
試劑的配制1)顯色液的配制稱量鉬酸銨5g，溶解于500ml 1M HCl中，用攪拌器攪拌，至全部溶解后在加入孔雀綠190mg，繼續(xù)攪拌至全部溶解，并用錫箔紙避光；2)緩沖液的配制①精密稱量Hepes 0.5958g，溶于5ml H2O中，用10M NaOH調PH至7.2，配制成終濃度為0.5M的Hepes；②精密稱量KCl 0.3728g，溶于5ml H2O中，配制成終濃度為1M的KCl；③精密稱量MgCl20.0255g，溶于1ml H2O中，配制成終濃度為125mM的MgCl2；④精密稱量EGTA 0.0476g，溶于5ml H2O中，用10M NaOH調PH至7.0，配制成終濃度為25mM的EGTA；⑤精密稱量G-1-P 0.0152g，溶于10ml H2O中，配制成終濃度為5mM的G-1-P；⑥精密稱量glycogen 10mg，溶于1ml H2O中，配制成終濃度為10mg/ml的glycogen；3)陽性藥caffeine溶液的配制將caffeine溶于10ml H2O配制0.5、5、50和500μM的溶液；4)配制GPa溶液取1μl的GPa加入到100μl反應體系中，終濃度為250ng/100μl；5)待測試化合物溶液的配制將待測試化合物溶于DMSO配制成濃度為10mM溶液，取2μl化合物溶液加入到反應體系中，終濃度為20μM.
測定rabbit肌糖原磷酸化酶活性的量效曲線通過讀取不同濃度的GPa加入顯色液后的在655nm下的OD值，來測定其量效曲線。由量效曲線可選擇GPa的量為250ng.
測定rabbit的肌糖原磷酸化酶的caffeine抑制曲線所測得的caffeine的IC50為57.54257μM，與文獻報道的IC50基本一致。
實驗步驟1)設計PC(陽性對照)、Blank(空白對照)、陽性藥(咖啡因)；2)加反應buffer52μl；3)加測試化合物至終濃度；4)加酶1μl，終濃度為250ng/100μl；5)加顯色液150μl；6)20～25攝氏度條件下反應20分鐘；7)在波長655nm條件下比色；8)數(shù)據的讀取及抑制率的計算抑制率＝[陽性對照-待測樣品]/[陽性對照-空白對照]。
測試結果表1列出了部分五環(huán)三萜化合物對rabbit肌糖原磷酸化酶的抑制活性數(shù)據，結果顯示，科羅索酸、熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、白樺脂酸、白樺脂醇及上述化合物的酯類衍生物等對糖原磷酸化酶具有顯著的抑制活性。
表1 五環(huán)三萜化合物對兔肌糖原磷酸化酶的抑制活性

實施例8對腎上腺素誘發(fā)的高血糖小鼠抑制血糖升高活性實驗動物和試劑昆明種小白鼠，體重20-23g，雌雄各半，由江寧青龍山動物養(yǎng)殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2002-0018，受試前在本室適應三天。腎上腺素注射液，武漢制藥集團股份有限公司。
方法取健康昆明種小白鼠，10只/組，隨機均分以下各試驗組溶媒對照組(0.5％CMC)，格列美脲組(10mg·kg-1)和待測化合物組(劑量分別為40和100mg·kg-1)。按實驗分組連續(xù)給藥7天，末次給藥前禁食過夜，在試驗當日給藥同時皮下注射腎上腺素150μg·kg-分別在各組小鼠給藥前和給藥后不同時間經小鼠眼眶靜脈叢取血，葡萄糖氧化酶法測定血糖值。
結果表2和表3列出了科羅索酸、熊果酸、山楂酸和齊墩果酸對腎上腺素誘導的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高活性數(shù)據，結果顯示，科羅索酸、熊果酸、山楂酸和齊墩果酸對腎上腺素誘導的小鼠血糖升高均有顯著的抑制活性。
表2、實驗化合物對腎上腺素誘導的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高mean±SD，n＝10.*P＜0.05，**P＜0.01，vs control

表3、實驗化合物對腎上腺素誘導的小鼠高血糖模型的抑制血糖升高mean±SD，n＝9.*P＜0.05，**P＜0.01，vs control。

權利要求
1.下述式I和式II所示的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應用， 式I中，R1代表氫或羥基；R2代表氫、1～10個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基；R3和R4分別代表氫或甲基，并且R3和R4不同時為氫；式II中，R5代表CH3、CH2OH、COOR6，這里R6代表氫、1～10個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
2.權利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，其特征在于式I中，R2代表氫、1～6個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基式II中，R6代表氫、1～6個碳的直鏈或支鏈烷基、芐基。
3.權利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，其特征在于式I中，R2代表甲基、乙基、異丙基；式II中，R6代表甲基、乙基、異丙基。
4.權利要求1的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，其特征在于式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們藥學上可接受的鹽或酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及它們藥學上可接受的鹽或酯。
5.權利要求4的五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯，其特征在于式I所代表的化合物包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸及它們的甲酯、乙酯或芐酯；式II所代表的化合物包括白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇及白樺脂酸的甲酯、乙酯或芐酯。
6.權利要求1所述五環(huán)三萜化合物及其藥學上可接受的鹽或酯在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應用，包括在制備抗糖尿病藥物上的應用。
7.具有糖原磷酸化酶抑制作用的藥物組合物，含有權利要求1所述五環(huán)三萜類化合物及其鹽或酯和藥學上可接受的載體。
8.權利要求7的藥物組合物，所述五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學上可接受的鹽或酯。
9.權利要求8的藥物組合物，所述五環(huán)三萜類化合物選自山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學上可接受的甲酯、乙酯或芐酯。
10.權利要求7的藥物組合物，所述抑制糖原磷酸化酶作用包括抗糖尿病作用。
全文摘要
五環(huán)三萜類化合物在制備抑制糖原磷酸化酶藥物中的應用，包括含山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸、白樺脂醇、白樺脂酸、羽扇豆醇或其藥學上可接受的鹽或酯的藥物組合物在制備治療糖尿病藥中的應用。
文檔編號A61P35/00GK1682740SQ20051003809
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月11日 優(yōu)先權日2005年3月11日
發(fā)明者孫宏斌, 溫小安, 柳軍, 張陸勇, 王善治, 倪沛洲 申請人:中國藥科大學