專(zhuān)利名稱(chēng)：類(lèi)脂－聚合物軛合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類(lèi)脂-聚合物軛合物、它們的制備和用途。
背景技術(shù)：
類(lèi)脂-聚合物軛合物是公知的，并用于多種不同的用途。其中之一是包含在膠體載體組合物中，例如泡狀雙層體系，如脂質(zhì)體、niosomes和反轉(zhuǎn)泡囊(reversed vesicles)，膠束體系，納米囊，納米球(nanospheres)等。這種膠體載體組合物的一種公知的代表物是通過(guò)脂質(zhì)體形成的。雖然本文此后特別提及的是脂質(zhì)體，但讀者應(yīng)記住，所述討論、公開(kāi)內(nèi)容和教導(dǎo)均還涉及其它膠體載體組合物。
屬于膠體載體顆粒組的脂質(zhì)體，是由包封有含水空間的一個(gè)或多個(gè)同心類(lèi)脂雙層組成的小泡囊(vesicles)。由于它們?cè)诖笮　⒈砻骐姾?、?lèi)脂組成、雙層流動(dòng)性方面的結(jié)構(gòu)多變性，并由于它們能包封幾乎各種藥物的能力，它們的作為給藥體系的重要性易于被人們所認(rèn)識(shí)。然而，在靜脈注射脂質(zhì)體時(shí)，它們被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)認(rèn)作是外來(lái)顆粒，并被快速地從循環(huán)清除到富含吞噬細(xì)胞的器官如肝、脾和骨髓中。人們已經(jīng)確認(rèn)了一些減少這種效應(yīng)的可能性，如降低脂質(zhì)體的顆粒尺寸和改變脂質(zhì)體的表面電荷。另一進(jìn)展涉及通過(guò)在脂質(zhì)體表面上引入特殊的親水聚合物組分而對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面改性，所述親水聚合物組分的基團(tuán)減少了蛋白質(zhì)在顆粒表面上的吸附。因而這種脂質(zhì)體可防止被MPS細(xì)胞辨認(rèn)，并在體循環(huán)中具有延長(zhǎng)的停留時(shí)間。脂質(zhì)體表面改性的一種公知實(shí)例是在制備脂質(zhì)體組合物的過(guò)程中引入親水聚合物聚乙二醇(PEG)的類(lèi)脂衍生物。通常這種聚合物是用憎水部分進(jìn)行末端改性的，所述憎水部分是磷脂酰乙醇胺衍生物或長(zhǎng)鏈脂肪酸的殘基。聚乙二醇本身是相當(dāng)穩(wěn)定的聚合物，它是排斥蛋白質(zhì)粘附的防護(hù)物，并且在生理?xiàng)l件下它不發(fā)生酶降解或水解降解。具有PEG-接枝表面的脂質(zhì)體對(duì)各種動(dòng)物以及對(duì)人靜脈給藥后，已在延長(zhǎng)血漿半衰期(half life)和減少在富含噬細(xì)胞的器官中積累方面獲得了良好結(jié)果(Storm G.，Belliot S.O.，Daemen T.And Lasic D.D.Surfacemodification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclearphagocyte system in Adv.Drug Delivery Rev.17，31-48，(1995)；Moghimi S.M.，Hunter A.C.and Murray J.C.Long-circulating andtarget-specific nanoparticles；theory to practice in Pharmacol.Rev.53，283-318，(2001)；Boerman O.C.，Dams E.T.，Oyen W.J.G.，CorstensF.H.M.and Storm G.Radiopharmaceuticals for scintigraphicimaging of infection and inflammation in Inflamm.Res.50，55-64，(2001))。含有阿霉素(doxorubicine)的這種脂質(zhì)體制劑已獲準(zhǔn)上市。
同時(shí)，在長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中使用聚合物聚乙二醇也有一些缺點(diǎn)。由于其非生物降解性，對(duì)PEG-接枝的脂質(zhì)體在巨噬細(xì)胞和皮膚中的積累有一些擔(dān)心。第二次注射PEG-脂質(zhì)體時(shí)觀(guān)察到失去長(zhǎng)循環(huán)性(快速清除)(Dams E.T.，Laverman P.，Oij en W.J.，Storm G.，Scherphof G.L.，Van der Meer J.W.，Corstens F.H.and Boerman O.C.Acceleratedblood clearance and altered biodistribution of repeated injections ofsterically stabilized liposomes in J.Pharmacol.Exp.Ther.292，1071-1079，(2000))。對(duì)應(yīng)用PEG-脂質(zhì)體的病人的最近的研究表明，PEG-脂質(zhì)體可引起急性的副作用(面部潮紅，胸緊(tightness of thechest)，呼吸短促，血壓改變)，當(dāng)PEG-脂質(zhì)體制劑的給藥(注入)結(jié)束時(shí)這些副作用立即消失。最近的數(shù)據(jù)指出了輔助活化在誘導(dǎo)副作用方面的影響(Szebeni J.，Baranyi L.，Savay S.，Lutz H.，Jelezarova E.，Bunger R.and Alving C.R.The role of complement activation inhypersensitivity to Pegylated liposomal doxorubicin(Doxil)in J.Liposome Res.10，467-481，(2000))。直到目前，市售的基于PEG-脂質(zhì)體的制劑是含水懸浮液制劑。眾所周知，總體上脂質(zhì)體含水懸浮液制劑以及PEG-脂質(zhì)體的保存期是相當(dāng)有限的。已知有一些技術(shù)來(lái)除去這種制劑的載體或連續(xù)相，如噴霧干燥，透濾法，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等，以及優(yōu)選的凍干。近來(lái)，提出了一種可改進(jìn)含有锝-螯合劑肼基煙酰胺的PEG-脂質(zhì)體的長(zhǎng)期保存期的凍干方法(Laverman P.，Van Bloois L.，Boerman O.C.，Oyen W.J.G.，Corstens F.H.M.and Storm G.Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labelled PEG-liposomes in J.Liposome Res.10(2&3)，page 117-129(2000))，但仍需要對(duì)所述結(jié)果和這種技術(shù)在脂質(zhì)體制劑中的應(yīng)用進(jìn)行深入研究。
使用聚乙二醇所固有的缺點(diǎn)促使研究者尋求替代的聚合物。作為合適的備選者，人們已建議了許多聚合物來(lái)將其用(形成泡囊(vesicle-forming)的)類(lèi)脂進(jìn)行衍生化(derivatising)，以結(jié)合到脂質(zhì)體中(參見(jiàn)例如EP-0688207)。親水的水溶性聚合物聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(丙烯?；鶈徇?、聚(2-甲基或乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酰胺和聚甘油已表現(xiàn)出一定程度的延長(zhǎng)脂質(zhì)體靜脈給藥后循環(huán)時(shí)間的作用。然而，直到目前為止，這類(lèi)類(lèi)脂-聚合物軛合物還未應(yīng)用于市售藥物制劑中，主要是因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)于已知的類(lèi)脂-PEG軛合物未表現(xiàn)出任何優(yōu)點(diǎn)。因而，現(xiàn)在還需要尋找一種聚合物，其可用類(lèi)脂衍生化以能夠結(jié)合到膠體載體組合物如脂質(zhì)體中，這種聚合物具有長(zhǎng)循環(huán)性能，此外還具有相對(duì)于PEG的優(yōu)點(diǎn)，如生物降解性。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了類(lèi)脂-聚合物軛合物，其可從由至少一種憎水非極性部分和一種親水極性頭基團(tuán)組成的兩親性類(lèi)脂和一種具有N-和C-末端基團(tuán)的聚合物或其單體前體獲得，其中所述聚合物是聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)或聚(氨基酸類(lèi)似物)，且其中所述類(lèi)脂與所述聚合物的N或C末端基團(tuán)共價(jià)連接，所述聚合物具有如下通式-[NHCHR(CH2)mCO]n-，其中-R定義為-H，-CH3，-CHCH3OR1，-(CH2)XOR1，-(CH2)X-CO-NHR1，-(CH2)XNH-CO-R1，-(CH2)X-SOyCH3，OR-(CH2)XCOOH；-R1或H或(C1-C4)烷基，由一或多個(gè)羥基或一個(gè)二(C1-C4)烷基氨基取代；x為0-4；m＝1或0，y＝1或2。本發(fā)明還提供了制備這種軛合物的方法和所述軛合物的用途。


圖1為具有不同總類(lèi)脂數(shù)量的含PEG-DSPE脂質(zhì)體制劑的血樣中注射劑量的計(jì)算百分比平均值隨時(shí)間變化的示意圖(實(shí)施例22)。
圖2為具有不同總類(lèi)脂數(shù)量的含PHEA-DODASuc脂質(zhì)體制劑的血樣中注射劑量的計(jì)算百分比平均值隨時(shí)間變化的示意圖(實(shí)施例22)。
圖3為在分別含有PEG-DSPE和PHEA-DODASuc的脂質(zhì)體制劑中包封的強(qiáng)的松龍磷酸鹽的百分比隨時(shí)間變化的示意圖(實(shí)施例23)。
圖4為包封在含PEG-DSPE和PHEA-DODASuc的脂質(zhì)體中的強(qiáng)的松龍磷酸鹽在血液中的濃度相對(duì)于時(shí)間變化的示意圖(實(shí)施例24)。
圖5為在靜脈單次注射鹽水和含強(qiáng)的松龍磷酸鹽的脂質(zhì)體(分別用PEG-DSPE和PHEA-DODASuc包覆)之前和之后，腳爪炎癥分?jǐn)?shù)隨時(shí)間變化的示意圖(實(shí)施例24)。
圖6為在分別含有作為類(lèi)脂-聚合物軛合物的PEG-DSPE、PHEG-二氨基丁烷DODASuc，PHPG二氨基丁烷DODASuc，PHBG二氨基丁烷DODASuc，和PHEA-DODASuc的脂質(zhì)體和常規(guī)脂質(zhì)體(裸露)靜脈給藥后，在肝、脾和肝+脾中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)體的百分比注射劑量的示意圖(實(shí)施例21)。
發(fā)明詳述在本發(fā)明組合物中的兩親性類(lèi)脂-聚合物軛合物可從兩親性類(lèi)脂和聚合物或聚合物的單體前體獲得。
在本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物中使用的兩親性類(lèi)脂可選自各種合成或天然存在的類(lèi)脂，所述類(lèi)脂由至少一個(gè)憎水非極性尾部基團(tuán)和親水極性頭部基團(tuán)組成，例如形成泡囊的類(lèi)脂和膜類(lèi)脂。
在類(lèi)脂-聚合物軛合物中使用的兩親性類(lèi)脂的一個(gè)重要特征是，所述類(lèi)脂在其極性頭部基團(tuán)上含有適于與聚合物鏈共價(jià)連接的官能團(tuán)。所述極性頭部基團(tuán)例如是伯或仲胺基團(tuán)、羥基、醛基、鹵素或羧基。所述類(lèi)脂的憎水性部分使得所述類(lèi)脂-聚合物軛合物能夠結(jié)合到雙層結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體中并用作錨定物(anchor)。
兩親性類(lèi)脂的實(shí)例是磷脂、糖脂、神經(jīng)酰胺、膽固醇和衍生物，飽和或部分不飽和的、支鏈或直鏈C8-C50單-或二-烷基胺，芳基烷基胺，環(huán)烷基胺，鏈烷醇，醛，碳鹵(carbohalides)或鏈烷酸和它們的酸酐，其中C原子總數(shù)優(yōu)選為25或更高。
更具體地說(shuō)，適用的兩親性類(lèi)脂的實(shí)例是卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂，十八胺，十四烷醇，膽固醇和棕櫚酸。
在類(lèi)脂-聚合物軛合物中優(yōu)選的兩親性類(lèi)脂是具有兩個(gè)憎水鏈(通常為烷基鏈)和上述的含有官能團(tuán)的極性頭部基團(tuán)的類(lèi)脂。磷脂酰乙醇胺衍生物，特別是二硬脂基磷脂酰乙醇胺是這種優(yōu)選的磷脂，因?yàn)樗鼈兒谢钚园被鶊F(tuán)。
另外的優(yōu)選的兩親性類(lèi)脂具有作為親水極性頭部基團(tuán)的伯或仲胺和兩個(gè)飽和或不飽和的C8-C50支鏈或直鏈憎水非極性部分。其實(shí)例是1-十七烷基十八烷基胺和含二硬脂基胺的化合物，如二硬脂基胺和N-丁二?；?二(十八烷基)胺(DODASuc)。
本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物的聚合物部分由聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)或聚(氨基酸類(lèi)似物)形成。聚(氨基酸衍生物)是一種聚合物，其由連接有一種或多種取代基的氨基酸單體組成。其實(shí)例是聚(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺。這里公開(kāi)的聚(氨基酸類(lèi)似物)是一種聚合物，其中氨基酸單體的碳原子鏈長(zhǎng)度被減少或延長(zhǎng)。其實(shí)例是聚(高絲氨酸)和聚(五碳高絲氨酸(pentahomoserine))。
所述聚合物是一種均聚物，其組成單體在整個(gè)聚合物鏈中是相同的。所述聚合物部分還可由嵌段共聚物組成，所述嵌段共聚物選自聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)和聚(氨基酸類(lèi)似物)，或者所述聚合物部分可以由一系列交替變化的單體或控制次序的單體來(lái)形成，或通過(guò)合適的選自一種或多種氨基酸、氨基酸衍生物和氨基酸類(lèi)似物的單體的無(wú)規(guī)聚合來(lái)形成。所述聚合物可以是直鏈或支鏈的，并包括接枝聚合物，但優(yōu)選是直鏈的。
適用的氨基酸是天然存在的α-氨基酸。但β-氨基酸以及非蛋白質(zhì)或非天然存在的氨基酸也是引人關(guān)注的。L-和D-構(gòu)型的氨基酸和衍生物均可使用。當(dāng)在類(lèi)脂-聚合物軛合物中的聚合物的氨基酸序列是通過(guò)L-氨基酸的殘基形成時(shí)，所得到的聚合物可進(jìn)行酶降解。另一方面，當(dāng)在本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物中的聚合物的氨基酸序列是通過(guò)D-氨基酸形成時(shí)，所得到的聚合物對(duì)肽降解酶很可能是穩(wěn)定的。也可使用L-和D-氨基酸的混合物?？紤]所述聚合物的不同性能，其中結(jié)合了本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物的膠體載體顆粒的表面改性，可通過(guò)選擇使用L-和/或D-型的起始物質(zhì)制備所述軛合物來(lái)進(jìn)行調(diào)整。
適于結(jié)合到本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物中的聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)和聚(氨基酸類(lèi)似物)化合物的一個(gè)重要性能是，它們可溶解于水中(在100份水中至少1份，優(yōu)選在30份水中1份，最優(yōu)選在10份或更少的水中1份)。所述聚合物還可通過(guò)它們?cè)谒械摩?參數(shù)來(lái)表征。這種聚合物-溶劑相互作用參數(shù)可由例如膜滲透壓測(cè)定法來(lái)確定?？捎欣赜糜诒景l(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物中的聚合物在水中的χ-參數(shù)≤0.65，優(yōu)選≤0.5。
所述聚合物的另一重要特征是，在4-8的(生理)pH范圍內(nèi)它們不含有顯著數(shù)量的荷電基團(tuán)。優(yōu)選地，在所述聚合物或氨基酸衍生物單體制備中使用中性氨基酸單體或氨基酸類(lèi)似物單體，它們是中性的或已被中和。當(dāng)存在荷電基團(tuán)時(shí)，可允許其以不干擾本發(fā)明的膠體載體組合物的長(zhǎng)循環(huán)性能的低百分比存在。對(duì)于2-羥乙基-L-谷氨酰胺和荷電單體的共聚物已證實(shí)，帶正電荷的基團(tuán)被允許存在的百分比大于帶負(fù)電荷的基團(tuán)。
除其它外，制備所述聚合物的合適單體有丙氨酸、蘇氨酸，纈氨酸，肌氨酸，α-氨基己二酸，α，γ-二氨基丁酸衍生物，鳥(niǎo)氨酸，谷氨酰胺和衍生物，包括谷氨酸，天冬酰胺和衍生物，包括天冬氨酸，賴(lài)氨酸衍生物，蛋氨酸和衍生物，絲氨酸，其衍生物和具有附加CH2基團(tuán)的類(lèi)似物，例如高絲氨酸和五碳高絲氨酸。合適的側(cè)基包括(C1-C4)-烷基，羥基烷基，二羥基烷基，酰胺(acid amides)和芳基或它們的組合，條件是所述聚合物保持水溶性。這些基團(tuán)的實(shí)例是2-羥基乙基，3-羥基丙基，4-羥基丁基和2，3-二羥基丙基?？墒褂玫木酆衔锸抢缇?D，L-絲氨酸)(PDLS)，聚(2-羥基乙基)-D，L-谷氨酰胺(PDLHEG)，聚(2-羥基丁基)-L-谷氨酰胺(PHBG)和共聚物聚(HEG-共聚-谷氨酸)1％谷氨酸(PHEG1％GA)。優(yōu)選的聚合物是聚(D，L-谷氨酰胺)(PDLG)，聚(D，L-天冬酰胺)(PDLA)，聚(羥基丙基)-L-谷氨酰胺(PHPG)，聚(2-羥基丙基)-L-谷氨酰胺(P2HPG)和β-丙氨酸與2-羥乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(PbAHEG)，含有5和1％二甲基氨基乙基側(cè)基的聚(HEG-共聚-二甲基氨基乙基-谷氨酰胺)(PHEG5％DG和PHEG1％DG)。更優(yōu)選的聚合物是均聚物聚-[N-(2-羥基乙基)-L-谷氨酰胺](PHEG)、聚(2-羥基乙基)-L-天冬酰胺(PHEA)和聚(D，L-蛋氨酸亞砜)(PDLMS)。
所述聚合物鏈含有5至500個(gè)單體子單元，優(yōu)選20至100個(gè)。所述聚合物的平均分子量為500至75000，優(yōu)選2000至15000。所述平均分子量可按本領(lǐng)域已知的不同方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在本申請(qǐng)的實(shí)施例中，分子量的評(píng)估基于NMR數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行。
為制備結(jié)合到本發(fā)明組合物中的類(lèi)脂-聚合物軛合物，優(yōu)選使用多種制備方法，其中在類(lèi)脂聚合和偶合之前，對(duì)氨基酸單體的側(cè)鏈中的活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。
可按照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備類(lèi)脂-聚合物軛合物。制備氨基酸聚合物的一種公知方法包括任選具有一個(gè)或多個(gè)保護(hù)基團(tuán)的相應(yīng)氨基酸N-羧基酸酐(NCA)的開(kāi)環(huán)聚合，該開(kāi)環(huán)聚合通過(guò)親核試劑如(C1-C4)烷基伯胺引發(fā)。獲得類(lèi)脂-聚合物軛合物的另一方法包括使用具有保護(hù)官能團(tuán)的胺如N-Boc-1，4-二氨基丁烷作為NCA開(kāi)環(huán)聚合的引發(fā)劑。雖然在這一方法中需要兩個(gè)額外的步驟，即官能團(tuán)去保護(hù)和隨后偶聯(lián)到具有活性基團(tuán)的類(lèi)脂上，但通過(guò)這一方法制備的類(lèi)脂-聚合物軛合物也適于結(jié)合到本發(fā)明的膠體載體組合物中。
如果所述兩親類(lèi)脂是C8-C50支鏈或直鏈的單或二-烷基、-羥基烷基或-亞烷基胺、鏈烷醇或神經(jīng)酰胺，這可有利地用作開(kāi)環(huán)聚合過(guò)程中的引發(fā)劑。這意味著在聚合過(guò)程中，所述兩親性類(lèi)脂會(huì)在一步中偶聯(lián)到所述聚合物上。所述聚氨基酸的分子量很大程度上取決于溶劑或溶劑混合物、使用的化學(xué)品的純度和單體/聚合引發(fā)劑的比值。一般來(lái)說(shuō)，單體/聚合引發(fā)劑的比值越高，聚合物的分子量越高。
當(dāng)制備預(yù)定組成的聚合物時(shí)，優(yōu)選使用固相肽合成方法。
可通過(guò)使用氨基醇如2-氨基乙醇、3-氨基丙醇或2，3-二羥基丙基胺的氨解來(lái)除去所述聚合物的重復(fù)單元中存在的保護(hù)基團(tuán)。
本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物可有利地結(jié)合到本發(fā)明的膠體載體組合物中，例如泡囊狀雙層系統(tǒng)，如脂質(zhì)體，niosomes和反轉(zhuǎn)泡囊，膠束系統(tǒng)，納米囊，納米球等。優(yōu)選的膠體載體體系是泡囊狀雙層系統(tǒng)。
在制備脂質(zhì)體時(shí)，將本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物與制備脂質(zhì)體通常使用的組分如形成泡囊的類(lèi)脂、穩(wěn)定劑等混合。包含的所述軛合物的摩爾濃度應(yīng)足以使脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間相對(duì)于不含類(lèi)脂-聚合物軛合物的相應(yīng)脂質(zhì)體延長(zhǎng)數(shù)倍。所述聚合物軛合物通常的含量為1-15％摩爾，優(yōu)選3-10％摩爾，最優(yōu)選5-7.5％摩爾。
通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)技術(shù)測(cè)定的脂質(zhì)體的平均尺寸低于200nm，優(yōu)選低于150nm，最優(yōu)選低于100nm。對(duì)于這種類(lèi)型的膠體載體顆粒來(lái)說(shuō)的下限是20nm。
當(dāng)結(jié)合到荷電的脂質(zhì)體中時(shí)，所述類(lèi)脂-聚合物軛合物表現(xiàn)出減少ζ電位的能力，從而證實(shí)所述聚合物接枝屏敝了表面電荷。
所述組合物可以以若干種途徑來(lái)給藥，但腸胃外給藥是優(yōu)選的。根據(jù)活性組分和所要治療的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥或病癥，可通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)等注射來(lái)進(jìn)行給藥。
在將本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑對(duì)小鼠靜脈內(nèi)給藥后，已發(fā)現(xiàn)所述脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間可根據(jù)所需的目的改變。所述血液循環(huán)時(shí)間取決于所使用的類(lèi)脂-聚合物軛合物，尤其是類(lèi)脂/聚合物組合的選擇、所述聚合物的分子量和接枝密度。對(duì)于例如其中兩親性類(lèi)脂含有雙憎水性尾部的類(lèi)脂-PHEG軛合物、類(lèi)脂-PHEA軛合物和類(lèi)脂-PDLMS軛合物(PHEG-二氨基丁烷DODASuc，PHEA-DODASuc和PDLMS-DODASuc)，已觀(guān)察到與用相應(yīng)的PEG-接枝的脂質(zhì)體得到的結(jié)果相似的結(jié)果。
與通用的脂質(zhì)體制劑相比，用本發(fā)明的類(lèi)脂-聚合物軛合物制備的脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性一般有改進(jìn)。此外，通過(guò)適當(dāng)選擇類(lèi)脂-聚合物軛合物可進(jìn)一步改進(jìn)脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性?？衫斫猓@種選擇還取決于活性劑的選擇。例如，在脂質(zhì)體制劑中用包封的皮質(zhì)類(lèi)固醇水溶性衍生物代替皮質(zhì)類(lèi)固醇本身，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體制劑穩(wěn)定性增加。將強(qiáng)的松龍磷酸鹽包封在含有聚羥乙基天冬酰胺-DODASuc軛合物的脂質(zhì)體中，得到比結(jié)合到含有聚(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺-二氨基丁烷-DODASuc軛合物的脂質(zhì)體中略好的結(jié)果。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法如噴霧干燥、凍干、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等從脂質(zhì)體組合物中除去含水介質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性的進(jìn)一步的改進(jìn)。
結(jié)合到本發(fā)明膠體載體組合物中的類(lèi)脂-聚合物軛合物給這些組合物提供了長(zhǎng)循環(huán)性能。長(zhǎng)循環(huán)性能應(yīng)被理解為，與不含有類(lèi)脂-聚合物軛合物的這種組合物相比，膠體載體組合物在血液中循環(huán)的時(shí)間有增加。所述長(zhǎng)循環(huán)性能可按照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)定(Torchilin VP，Shtilman MI，Trubetskoy VS，Whiteman K，Milstein AM.Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulationtime in vivo.Biochimica et Biophysica Acta(1994)1195181-184；Torchilin VP，Trubetskoy VS，Whiteman KR，Caliceti P，F(xiàn)erruti P，Verones FM.New synthetic amphiphilic polymers for stericprotection of liposomes in vivo.Journal of pharmaceutical sciences(1995)84(9)1049-1053)。對(duì)脂質(zhì)體，實(shí)施例中提供了一種方法。因而，這種組合物，尤其是泡囊組合物可用于許多種應(yīng)用。除作為循環(huán)藥物貯器外，它們例如通過(guò)與導(dǎo)向裝置(homing devices)如單克隆抗體結(jié)合，可用于被動(dòng)指向病理部位(腫瘤、感染、炎癥)和主動(dòng)指向在血流中的細(xì)胞、內(nèi)皮(如血管生成相關(guān)的受體)。其它的應(yīng)用可以是人造輸氧系統(tǒng)，血池顯象和生物材料如導(dǎo)尿管和血管假體的防污涂層。
此外，類(lèi)脂-聚合物軛合物是可生物降解的，因而提供了許多優(yōu)點(diǎn)，尤其是在人或動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞中沒(méi)有積累的危險(xiǎn)。
另外，與PEG-脂質(zhì)體相比，類(lèi)脂-聚合物軛合物表現(xiàn)出降低的類(lèi)脂劑量依賴(lài)性。
另外一個(gè)但是很重要的優(yōu)點(diǎn)是，在第二次注射本發(fā)明的組合物后不總是觀(guān)察到增加的清除性，且血液循環(huán)時(shí)間的減少是適度的。這意味著與用PEG包覆的膠體載體組合物相比的顯著的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的膠體載體組合物提供了用于治療、診斷、預(yù)防等中的很多的可能性。由于類(lèi)脂-聚合物軛合物，可根據(jù)目的來(lái)進(jìn)行選擇的組分，和各種可選擇的膠態(tài)載體體系的多樣性，顯而易見(jiàn)，一般可為各種活性劑設(shè)計(jì)適宜的膠體載體組合物。如果在初次實(shí)驗(yàn)中，在本發(fā)明的組合物靜脈給藥后未觀(guān)察到對(duì)血液循環(huán)時(shí)間的影響或僅觀(guān)察到微弱的影響，本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變?cè)陬?lèi)脂-聚合物軛合物中的許多不同參數(shù)(如分子量、接枝密度、聚合物、類(lèi)脂等)和膠體載體組成參數(shù)，以按照標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定增加循環(huán)時(shí)間。當(dāng)本發(fā)明的組合物含有水溶性皮質(zhì)類(lèi)固醇作為活性劑時(shí)，觀(guān)察到很令人感興趣的效果。在一個(gè)體內(nèi)關(guān)節(jié)炎模型實(shí)驗(yàn)中，這種組合物的一次靜脈注射表現(xiàn)出與未包封或包封在常規(guī)脂質(zhì)體中的皮質(zhì)類(lèi)固醇化合物重復(fù)注射同樣有效的效果。感興趣的水溶性皮質(zhì)類(lèi)固醇是布地奈德磷酸酯和9-去氟膚輕松和氟替卡松丙酸酯的水溶性衍生物。有利的效果是與關(guān)節(jié)炎有關(guān)癥狀的完全的和長(zhǎng)時(shí)間的緩解，而由于減少了要施用的皮質(zhì)類(lèi)固醇的數(shù)量并因?yàn)榭墒褂猛ǔＷ匝褐斜豢焖偾宄钠べ|(zhì)類(lèi)固醇，降低了與基于皮質(zhì)類(lèi)固醇的療法相關(guān)的副作用。此外在其中皮質(zhì)類(lèi)固醇是選擇的藥物或用作并用療法(co-therapy)的其它疾病中，可容易地確認(rèn)本發(fā)明組合物的有益效果。但在本發(fā)明組合物中其它活性劑也表現(xiàn)出令人感興趣的效果。
雖然為了清楚和便于理解的目的而以舉例和實(shí)例的方式，一定程度地詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易明白，在本發(fā)明的教導(dǎo)下，在不偏離所附權(quán)利要求書(shū)范圍的條件下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一些變化和修改。
如下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例1具有十七烷基十八烷基胺端基的聚(L-谷氨酸γ-芐酯)(PBLG-十七烷基十八烷基胺)在氮?dú)夥障?，?.94g(3.6mmol)L-谷氨酸γ-芐酯N-羧基酸酐(NCA)溶于5ml干燥DMF中。立即添加25mg(0.05mmol)1-十七烷基-十八烷基胺(Sigma Aldrich)在1ml干燥氯仿中的溶液。幾乎即刻就形成氣泡(CO2)。所述溶液在室溫下攪拌1天，然后沉淀在10-20倍過(guò)量的水中。收集白色沉淀物并在真空中干燥。產(chǎn)量0.75g。
表征在CDCl3中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ，單位ppm)谷氨酸芐酯7.2(C6H5)，5.0(芐基的CH2)，3.9(α-CH)，2.8&2.2(β&γCH2)，烷基鏈1.2(CH2烷基鏈)，0.85(CH3)。
實(shí)施例2具有十七烷基十八烷基胺端基的聚(N-(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺)(PHEG-十七烷基十八烷基胺)向0.60g PBLG-十七烷基-十八烷基胺(參見(jiàn)以上)在5ml干燥DMF中的溶液中，加入0.15g 2-羥基吡啶和0.8ml乙醇胺。將這一溶液在室溫下氮?dú)夥罩袛嚢?天。將該溶液沉淀在10-20倍過(guò)量的乙醚中。收集產(chǎn)物并在真空中干燥。將水溶性聚合物產(chǎn)物在纖維素酯滲析管(MWCO 500)中對(duì)水滲析2天。在冷凍干燥后獲得純化的具有十七烷基十八烷基端基的PHEG。產(chǎn)量0.30g。
表征在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ，單位ppm)羥乙基谷氨酰胺4.1(α-CH)，2.2&1.8-1.9(β&γCH2)，3.4(CH2-OH)，3.1(CH2-NH2)，烷基鏈1.2(CH2烷基鏈)，0.8(CH3)。
由硬脂基信號(hào)和α-CH信號(hào)的積分比值，估計(jì)出PHEG分子量為12000。
實(shí)施例3具有通過(guò)N-Boc-1，4-二氨基丁烷作為引發(fā)劑引入的二硬脂基胺端基的聚[N-(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺](PHEG-二氨基丁烷-DODASuc)將2.5g(9.5mmol)L-谷氨酸γ-芐酯N-羧基酸酐溶于2.5ml干燥乙酸乙酯和12.5ml干燥二氯甲烷的混合物中，并添加N-Boc-1，4-二氨基丁烷在二氯甲烷中的1M溶液0.95ml(0.95mmol)作為引發(fā)劑。所述混合物在氮?dú)夥罩惺覝叵聰嚢?天，然后沉淀在甲醇中。產(chǎn)量1.48gPBLG-N-Boc-二氨基丁烷。
1H-NMR(CDCl3)譜在δ1.4-1.3處顯示出N-Boc-1，4-二氨基丁烷信號(hào)。
Maldi TOF ms重復(fù)的谷氨酸芐酯單元的質(zhì)量n×219。
m/z 1417(n＝5)，1636(n＝6)，1855(n＝7)，2074(n＝8)，對(duì)應(yīng)于具有N-Boc-1，4-二氨基丁烷(187Da)基團(tuán)和環(huán)肽端基(112Da)的鈉加合物的質(zhì)量。
m/z 1433(n＝5)，1652(n＝6)，1872(n＝7)，對(duì)應(yīng)于具有N-Boc-1，4-二氨基丁烷(187Da)基團(tuán)和環(huán)肽端基(112Da)的鉀加合物的質(zhì)量。
PBLG-N-Boc-二氨基丁烷的脫保護(hù)將738mg PBLG-N-Boc-二氨基丁烷在5ml在二噁烷中的4N HCl溶液中攪拌3.5小時(shí)。隨后在Rotavap上蒸發(fā)所述反應(yīng)混合物。將殘余物溶解于5ml四氫呋喃中，并滴加到80ml的NaHCO3溶液(6.5gNaHCO3溶解在水中)中。過(guò)濾出產(chǎn)物，用水洗滌并在真空中干燥。產(chǎn)量677mg PBLG-二氨基丁烷。
1H-NMR(CDCl3)顯示成功地除去了保護(hù)基團(tuán)。
Maldi TOF質(zhì)譜分析顯示了所需的摩爾質(zhì)量。
重復(fù)的谷氨酸芐酯單元的質(zhì)量n×219。
m/z 1318(n＝5)，1537(n＝6)，1756(n＝7)，1976(n＝8)，對(duì)應(yīng)于具有1，4-二氨基丁烷(87Da)基團(tuán)和環(huán)肽端基(112Da)的鈉加合物的質(zhì)量。
與DODASuc的偶聯(lián)將62mg(0.1mmol)的N-丁二酰-二-十八烷基胺(DODASuc，Schmitt et al，J.Am.Chem.Soc.1994，116，19，8485-8491)，13.7mg(0.12mmol)的N-羥基丁二酰亞胺和0.66mg的二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解于2ml的二氯甲烷中。在冷卻到0℃后，添加24.6mg(0.12mmol)的N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。在0℃下將所述溶液攪拌1小時(shí)，并在室溫下攪拌過(guò)夜。然后過(guò)濾出不溶解的二環(huán)己基脲，濾液添加到200mg PBLG-二氨基丁烷在3ml二氯甲烷和14μl三乙胺中的溶液中。在室溫下攪拌過(guò)夜后，將所述溶液滴加到甲醇中，過(guò)濾并干燥。產(chǎn)量135mg。1H-NMR(CDCl3))譜表明存在二硬脂基，CH2信號(hào)在δ1.4-1.2處，CH3信號(hào)在δ0.9-0.8處。
Maldi TOF質(zhì)譜分析顯示了所需的摩爾質(zhì)量，表明DODASuc已與PBLG-二氨基丁烷偶聯(lián)。
m/z 1922(n＝5)，2141(n＝6)，2360(n＝7)，2580(n＝8)，2799(n＝9)，3018(n＝10)，對(duì)應(yīng)于具有環(huán)肽端基(112Da)的PBLG-二氨基丁烷-DODASuc的鈉加合物的質(zhì)量。
結(jié)構(gòu) 氨解。
將120mg的PBLG-二氨基丁烷DODASuc和10.8mg的2-HP溶解于1.3ml的二甲基甲酰胺中，并加入0.68ml的2-氨基乙醇。在40℃下氮?dú)夥罩袛嚢?4小時(shí)后，將所述溶液滴加到氯仿中。過(guò)濾出產(chǎn)物并在真空中干燥。產(chǎn)量83mg的PHEG-二氨基丁烷-DODASuc。
1H-NMR(DMSO)在δ1.2-1.4(CH2)處和δ0.8-0.9(CH3)處顯示了二硬脂基信號(hào)。
由硬脂基信號(hào)和α-CH信號(hào)的積分的比值，估計(jì)出PHEG分子量為4000。
結(jié)構(gòu)
實(shí)施例4具有通過(guò)二硬脂基胺作為引發(fā)劑引入的胺端基的聚[N-(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺]將1.0g(3.8mmol)L-谷氨酸γ-芐酯N-羧基酸酐溶解于1ml干燥乙酸乙酯和5ml干燥氯仿的混合物中。隨后添加2ml(0.19mmol)由163mg二硬脂基胺溶解在3.26ml氯仿中形成的溶液。燒瓶裝有CaCl2管，并將所述混合物在氮?dú)庵惺覝叵聰嚢?天。將所述混合物滴加到甲醇中，通過(guò)過(guò)濾分離出聚合物并在真空中干燥。產(chǎn)量757mg PBLG-二硬脂基胺。
反應(yīng) 1H-NMR(CDCl3)分析顯示了在產(chǎn)物中的二硬脂基的信號(hào)CH3信號(hào)在δ0.9(t)處，CH2信號(hào)在δ1.3-1.2處。
Maldi TOF ms重復(fù)的谷氨酸芐酯單元的質(zhì)量n×219。
m/z 1971(n＝6)，2190(n＝7)，2410(n＝8)，2629(n＝9)，2848(n＝10)，對(duì)應(yīng)于具有二硬脂基胺(521Da)基團(tuán)和環(huán)肽端基(112Da)的鈉加合物的質(zhì)量。
m/z 2206(n＝7)，2427(n＝8)，對(duì)應(yīng)于具有二硬脂基胺(521Da)基團(tuán)和環(huán)肽端基(112Da)的鉀加合物的質(zhì)量。
氨解以上制備的PBLG-二硬脂基胺(600mg)與氨基乙醇和作為催化劑的2-羥基吡啶在二甲基甲酰胺中進(jìn)行氨解，得到430mg的PHEG-二硬脂基胺。
1H-NMR(DMSO-d6)顯示了二硬脂基胺信號(hào)。
結(jié)構(gòu) 實(shí)施例5具有二氨基丁烷DODASuc端基的聚[N-(羥基烷基)-L-谷氨酰胺]PBLG-二氨基丁烷BOC向3g L-谷氨酸γ-芐酯N-羧基酸酐(NCA)在8ml干燥DMF中的溶液中，添加0.1g N-BOC-1，4-二氨基丁烷在1ml氯仿中的溶液。在第一小時(shí)內(nèi)注意到有氣體(二氧化碳)形成。將這一溶液在氮?dú)夥罩杏谑覝叵聰嚢?天。在沉淀到約100ml甲醇中后，過(guò)濾出聚合物并進(jìn)行干燥，得到2g含有BOC保護(hù)的氨基的PBLG。
1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)BOC1.4(CH3)PBLG2.2 & 2.6(β，γ-CH2)，4.0(α-CH)，5.0(芐基的CH2)，7.3(苯基)。
PBLG-二氨基丁烷(除去保護(hù)性的BOC基團(tuán))將1.1g PBLG-二氨基丁烷BOC在5ml的4N HCl/二噁烷中的溶液攪拌3-4小時(shí)，然后滴加到約80ml的NaHCO3溶液(6.5g NaHCO3溶解在水中)中。過(guò)濾出產(chǎn)物，用水洗滌，并在真空中干燥。產(chǎn)量1gPBLG-二氨基丁烷。
1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)PBLG2.2 & 2.6(β，γ-CH2)，4.0(α-CH)，5.0(芐基的CH2)，7.3(苯基)。
BOC信號(hào)不存在。
PBLG-二氨基丁烷DODASuc(DCC偶聯(lián))將170mg的N-丁二酰-二-十八烷基胺(DODASuc)、90mg的DCC和10mg的4-(二甲基氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸鹽(DPTS)溶解于4ml二氯甲烷中。在室溫下將這一溶液攪拌1小時(shí)。添加0.73g PBLG-二氨基丁烷和40μl三乙胺在3ml氯仿中的溶液。在室溫下攪拌過(guò)夜后，將該溶液(含有二環(huán)己基脲沉淀)滴加到過(guò)量甲醇中(約100ml)。過(guò)濾出聚合產(chǎn)物并干燥。產(chǎn)量0.5g。
1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.9(CH3)和1.2-1.4(CH2)PBLG2.2 & 2.6(β，γ-CH2)，4.0(α-CH)，5.0(芐基的CH2)，7.3(苯基)5.1 PHEG-二氨基丁烷DODASuc按下述方法，用乙醇胺氨解PBLG-二氨基丁烷DODASuc，獲得PHEG-二氨基丁烷DODASuc將0.5g PBLG-二氨基丁烷DODASuc和15mg 2-羥基吡啶溶解于4mlDMF中。然后添加2ml乙醇胺。在氮?dú)夥罩?0℃下攪拌24小時(shí)后，將該溶液沉淀在約100ml乙醚中。將PHEG-二氨基丁烷DODASuc溶解于水中，滲析(MWCO 500)并隨后冷凍干燥，得到0.35g純化的PHEG二氨基丁烷DODASuc軛合物。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.85(CH3)和1.2-1.5(亞甲基質(zhì)子)PHEG1.7-2.2(β，γ-CH2)，3.1 & 3.3(羥乙基)，4.2(α-CH)，4.7(OH)，7.8 & 8.2(NH)由二硬脂基信號(hào)和α-CH信號(hào)的積分的比值計(jì)算出PHEG分子量為約4000。
Maldi-TOF確認(rèn)了PHEG二氨基丁烷DODASuc軛合物的分子結(jié)構(gòu)。
Na+-加合物m/z 3064.5(n＝13)，3236.1(n＝14)，3408.7(n＝15)，3580.6(n＝16)，3752.9(n＝17)，3924.7(n＝18)，4096.7(n＝19)，4268.4(n＝20)，4441.1(n＝21)，4613.3(n＝22)，4785.1(n＝23)，等。
5.2聚[(2-羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc按下述程序，用2-丙醇胺(異丙醇胺)氨解PBLG-二氨基丁烷DODASuc來(lái)獲得聚[(2-羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc將0.15g PBLG-二氨基丁烷DODASuc和0.05g 2-羥基吡啶溶解于4mlDMF中。然后添加1ml的2-丙醇胺。在氮?dú)夥罩?0℃下攪拌24小時(shí)后，將該溶液沉淀在約100ml乙醚中。在干燥后得到0.1gPHisoPG-二氨基丁烷DODASuc。將聚合物溶解于水中，滲析(MWCO500)并隨后冷凍干燥，得到純化的聚[(2-羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.85(CH3)和1.2-1.5(亞甲基質(zhì)子)PHPG1.7-2.2(β，γ-CH2)，1.0(CH3)& 3.0 & 3.3 & 3.7(羥丙基)，4.2(α-CH)，4.7(OH)，7.8 & 8.2(NH)計(jì)算出的分子量約4000。
5.3聚[(3-羥丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc用3-丙醇胺對(duì)PBLG-二氨基丁烷DODASuc進(jìn)行氨解來(lái)獲得聚[(3-羥丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc將0.3g PBLG-二氨基丁烷DODASuc和0.1g 2-羥基吡啶溶解于4mlDMF中。然后添加2ml的3-丙醇胺。在氮?dú)夥罩?0℃下攪拌24小時(shí)后，將該溶液沉淀在約100ml乙醚中。在干燥后得到0.25gPHPG5000-二氨基丁烷DODASuc。將聚合物溶解于水中，滲析(MWCO 500)并隨后冷凍干燥，得到純化的聚[(3-羥丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.85(CH3)和1.2-1.5(亞甲基質(zhì)子)PHPG1.7-2.2(β，γ-CH2)，1.5 & 3.1 & 3.3(羥丙基)，4.2(α-CH)，4.6(OH)，7.8 & 8.2(NH)分子量約5000。
Maldi-TOFNa+-加合物m/z 3623(n＝15)，3810(n＝16)，3996(n＝17)，4182(n＝18)，4368(n＝19)，4555(n＝20)，等。
5.4聚[(4-羥基丁基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc用4-丁醇胺對(duì)PBLG-二氨基丁烷DODASuc進(jìn)行氨解來(lái)獲得聚[(4-羥基丁基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc將0.3g PBLG-二氨基丁烷DODASuc和0.1g 2-羥基吡啶溶解于4mlDMF中。然后添加2ml的4-丁醇胺。在氮?dú)夥罩?0℃下攪拌48小時(shí)后，將該溶液沉淀在約100ml乙醚中。將聚合物溶解于水中，滲析(MWCO 500)并隨后冷凍干燥，得到0.2g純化的聚[(4-羥基丁基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.85(CH3)和1.2-1.5(亞甲基質(zhì)子)PHBG1.7-2.2(β，γ-CH2)，1.4 & 3.1 & 3.3(羥丁基)，4.2(α-CH)，4.5(OH)，7.8 & 8.2(NH)分子量約4000。
5.5聚[(2，3-二羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc用2，3-二羥基丙基胺對(duì)PBLG-二氨基丁烷DODASuc進(jìn)行氨解來(lái)獲得聚[(2，3-二羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc將0.15g PBLG-二氨基丁烷DODASuc和0.06g 2-羥基吡啶溶解于3mlDMF中。然后添加1ml的2，3-二羥基丙基胺。在氮?dú)夥罩?0℃下攪拌1天后，將該溶液沉淀在約100ml乙醚中。將聚合物溶解于水中，滲析(MWCO 500)并隨后冷凍干燥，得到0.1g純化的聚[(2，3-二羥基丙基)-L-谷氨酰胺]二氨基丁烷DODASuc。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基信號(hào)0.8-0.85(CH3)和1.2-1.5(亞甲基質(zhì)子)聚(二羥基丙基)G1.7-2.2(β，γ-CH2)，3.1 & 3.3-3.6(二羥基丙基)，4.2(α-CH)，4.6 & 4.8(OH)，7.8 & 8.2(NH)分子量約4000。
實(shí)施例6膽甾醇基(cholesteryl)-PHEG向0.2g PBLG-NH2和20μl三乙胺在2ml氯仿中的溶液中，添加0.07g氯甲酸膽甾醇酯在1ml氯仿中的溶液。將該溶液在室溫下攪拌約1小時(shí)，然后沉淀在乙醚中。在收集并干燥后，得到0.13g聚合產(chǎn)物。
用乙醇胺在40℃下氨解1天(2-羥基吡啶用作催化劑)，得到膽甾醇基PHEG。通過(guò)滲析(MWCO 500)純化所述聚合產(chǎn)物。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)PHEG1.7-2.2(β，γ-CH2)，3.1 & 3.3(羥基乙基)，4.2(α-CH)，4.7(OH)，7.8 & 8.2(NH)膽甾醇基0.6-1.6分子量約4000。
Maldi-TOF確認(rèn)了膽甾醇基-PHEG軛合物的分子結(jié)構(gòu)。
Na+-加合物m/z 3046(n＝14)，3218(n＝15)，3390(n＝16)，3562(n＝17)，3735(n＝18)，3907(n＝19)，4080(n＝20)，等。
實(shí)施例7聚(2-羥乙基)-DL-谷氨酰胺二氨基丁烷DODASuc該合成與聚(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺二氨基丁烷DODASuc的合成(實(shí)施例8)相似，但一些細(xì)節(jié)不同由L-谷氨酸γ-芐酯和D-谷氨酸γ-芐酯的1∶1混合物來(lái)合成γ-芐基-DL-谷氨酰胺NCA，并從乙酸乙酯/己烷(約1∶5)中結(jié)晶(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
將聚(芐基-DL-谷氨酰胺)二氨基丁烷BOC沉淀在水中而不是甲醇中。
將聚(芐基-DL-谷氨酰胺)二氨基丁烷DODASuc沉淀在甲醇中。
NMR譜實(shí)質(zhì)上與聚(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺二氨基丁烷DODASuc(實(shí)施例8.1)的NMR譜相同。
分子量約3000。
實(shí)施例8PHEG共聚物聚(HEG-共聚-谷氨酸)二氨基丁烷DODASuc；5％谷氨酸將0.14g PBLG二氨基丁烷DODASuc、0.05g 2-羥基吡啶、約1ml乙醇胺在1.5ml DMF中的溶液在氮?dú)夥罩性谑覝叵聰嚢枰惶?。然后將該溶液沉淀在乙醚中。收集并干燥產(chǎn)物，即部分乙醇胺氨解的PBLG二氨基丁烷DODASuc(具有5％芐基酯側(cè)基的PHEG)。在DMSO中測(cè)定的NMR表明存在5％的未反應(yīng)的芐基基團(tuán)。
將所述聚合物溶解于8.5ml的1M NaOH中并攪拌4小時(shí)。用1NHCl中和所述溶液，然后滲析(MWCO 500)數(shù)天。在將所述滲析過(guò)的溶液冷凍干燥后，得到帶負(fù)電荷的(在生理pH下)的共聚物-類(lèi)脂-軛合物(0.1g)。
在DMSO中的NMR表明芐基基團(tuán)完全轉(zhuǎn)化。
使用Maldi TOF來(lái)確認(rèn)谷氨酸和羥乙基谷氨酰胺重復(fù)單元的存在。
分子量約3500。
實(shí)施例9PHEG共聚物聚(HEG-共聚-二甲基氨基乙基谷氨酰胺)二氨基丁烷DODASuc；5％二甲基氨基乙基側(cè)基將0.25g PBLG二氨基丁烷DODASuc、0.08g 2-羥基吡啶和1ml乙醇胺在2.5ml DMF中的溶液在氮?dú)夥罩性谑覝叵聰嚢瓒?。將得到的溶液沉淀在乙醚中。收集并干燥所述部分乙醇胺氨解的PBLG二氨基丁烷DODASuc(具有5％芐基酯側(cè)基的PHEG)。在CDCl3中測(cè)定的NMR表明存在5％的未反應(yīng)的芐基基團(tuán)。
將0.16g這種部分乙醇胺氨解的PBLG二氨基丁烷DODASuc、0.06g 2-羥基吡啶、1ml N，N-二甲基乙二胺在2.5ml DMF中的溶液在氮?dú)夥罩性?0℃下攪拌1天。沉淀在乙醚中得到一種粉末，收集所述粉末并在真空中干燥。在DMSO中的NMR表明殘余芐基基團(tuán)完全轉(zhuǎn)化。將產(chǎn)物溶解在水中并滲析(MWCO 500)數(shù)天，隨后冷凍干燥。得到0.1g帶正電荷的PHEG共聚物-類(lèi)脂軛合物。
分子量約4000。
實(shí)施例10分別具有硬脂胺和十七烷基十八烷基胺端基的聚(2-羥乙基)-L-天冬酰胺(PHEA)L-天冬氨酸β-芐基酯N-羧基酸酐(NCA)將5g L-天冬氨酸β-芐基酯在含有約16ml 20％光氣甲苯溶液的50ml蒸餾過(guò)的THF中的懸浮液在60-65℃下進(jìn)行加熱(在所述溶液上通氮?dú)饬?。在約10分鐘后，得到澄清的溶液。在約1.5小時(shí)后，將該溶液緩慢傾倒到約140ml的正己烷中。幾乎立即形成晶體。在-20℃下進(jìn)一步結(jié)晶過(guò)夜后，分離出NCA結(jié)晶產(chǎn)物。從THF/己烷和從熱氯仿中進(jìn)一步結(jié)晶得到4.3g微細(xì)針狀物。(Biopolymers 1976，15(9)1869-71)。
1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)芐基基團(tuán)7.3(苯基)，5.1(CH2)天冬氨酸酯NCA2.8&3.0(β-CH2)，4.5(α-CH)，6.4(NH)硬脂基-PBLA向0.95g L-天冬氨酸β-芐基酯NCA在2mlDMF中的溶液中，添加0.04g硬脂胺在0.5ml氯仿中的溶液。在60℃下攪拌數(shù)小時(shí)后，將渾濁溶液沉淀在甲醇中。在干燥后，得到0.56g的聚(L-天冬氨酸芐基酯)硬脂胺。
十七烷基十八烷基-PBLA向0.5g L-天冬氨酸β-芐基酯NCA在2ml DMF中的溶液中，添加在約1ml氯仿中的0.1g 1-十七烷基十八烷基胺。在室溫下攪拌3天后，將渾濁溶液沉淀在甲醇中。得到0.2g的聚合產(chǎn)物PBLA-十七烷基十八烷基胺。
硬脂基-/十七烷基十八烷基-PHEA使用乙醇胺和作為催化劑的2-羥基吡啶，對(duì)以上的PBLA-軛合物在40℃下氨解1天，隨后沉淀在乙醚中，得到水溶性的聚(羥乙基)L-天冬酰胺(PHEA)，其分別含有硬脂基或十七烷基十八烷基尾部。通過(guò)滲析(MWCO 500)對(duì)所述類(lèi)脂-聚合物軛合物進(jìn)行純化。
硬脂基-PHEAMaldi-TOFNa+-加合物m/z 2823(n＝16)，2981(n＝17)，3139(n＝18)，3297(n＝19)，3455(n＝20)，3613(n＝21)等。
由Maldi-TOF確證，各PHEA鏈含有游離氨基端基。
十七烷基十八烷基-PHEANMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)十七烷基十八烷基0.8&1.2PHEA2.2-2.6(β-CH2)，3.1&3.4(羥乙基)，4.5(OH+α-CH)，7.8&8.3(NH)分子量約6000。
實(shí)施例11聚(2-羥乙基)-L-天冬酰胺DODASucPBLA DODASuc向1.7g L-天冬氨酸β-芐基酯N-羧基酸酐(NCA)在5ml DMF中的溶液中，添加0.2ml的甲基胺在THF中的2M溶液。將所述澄清溶液攪拌一天，然后沉淀在甲醇(約100ml)和水(250ml)的混合物中。得到1.3g PBLA，含有甲基酰胺和氨基端基。
將0.4g PBLA、30mgDCC、10mgDPTS和100mg N-丁二酰基-二硬脂基胺在5ml DMSO和1ml氯仿中的溶液攪拌一天，然后沉淀在水中。聚合產(chǎn)物用乙醚攪拌/洗滌并干燥。
PHEA DODASuc
將PBLA DODASuc用乙醇胺(使用2-羥基吡啶作為催化劑)在DMF溶液中，在40℃下氨解1天，得到PHEA DODASuc(0.2g，在滲析和冷凍干燥后)。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2-N)PHEA2.4-2.8(β-CH2)，3.2&3.4(羥乙基)，4.6(α-CH+OH)，7.8-8.5(NH)計(jì)算的分子量約3000。
Maldi-TOF確認(rèn)了PHEA DODASuc軛合物的分子結(jié)構(gòu)Na+-加合物m/z 2084(n＝9)，2243(n＝10)，2401(n＝11)，2559(n＝12)，2718(n＝13)，2876(n＝14)，等。
實(shí)施例12聚(2-羥乙基)-L-天冬酰胺DSPESuc軛合物PBLA(聚L-天冬氨酸芐基酯)氨解后得到具有氨基末端的PHEA，所述PBLA通過(guò)L-天冬氨酸芐基酯NCA的甲基胺引發(fā)的聚合來(lái)得到。丁二?；腄SPE(其合成類(lèi)似于在JACS，116，8485(1994)中描述的DPPE的合成)首先使用DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)就地轉(zhuǎn)化為其N(xiāo)HS酯將70mg丁二酰基化的DSPE、20mgNHS(N-羥基丁二酰亞胺)、5mgDMAP和30mgDCC(二環(huán)己基碳二亞胺)在2ml二氯甲烷中的溶液攪拌約3-4小時(shí)。向該混合物中添加0.13g氨基終端的PHEA(分子量約4000)在2mlDMSO中的溶液。在攪拌過(guò)夜后，將該混合物沉淀在乙醚中。收集所述沉淀物并溶解在水中，滲析(MWCO500)數(shù)天。在冷凍干燥后，得到約80mgPHEA-DSPE。
1H-NMR(DMSO-d6)(相對(duì)于溶劑峰的δ)
DSPE0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2-N)PHEA2.4-2.8(β-CH2)，3.2&3.4(羥乙基)，4.6(α-CH+OH)，7.8-8.4(NH)計(jì)算的分子量約4000。
實(shí)施例13聚(DL-絲氨酸)DODASucO-芐基-DL-絲氨酸N-羧基酸酐(NCA)將2.5g O-芐基-DL-絲氨酸在含有約10ml 20％光氣甲苯溶液的30ml蒸餾過(guò)的(干燥)THF中的懸浮液在60-65℃下進(jìn)行加熱(氮?dú)饬鹘?jīng)過(guò)所述溶液上面)。在約5分鐘后，得到澄清的溶液。在約1.5小時(shí)后，將所述溶液緩慢傾倒在約100ml正己烷中。產(chǎn)物呈油狀分離出來(lái)。將溶劑潷析，并將所述油狀物溶解在約25ml的乙酸乙酯中，向其中緩慢添加100ml的己烷。在劇烈搖動(dòng)燒瓶并在-20℃冷凍后，O-芐基-DL-絲氨酸NCA開(kāi)始結(jié)晶。從乙酸乙酯/己烷和/或從氯仿/己烷中的類(lèi)似重結(jié)晶給出2g的結(jié)晶物質(zhì)。(Biopolymers 1976，15(9)1869-71)1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)芐基基團(tuán)4.5(CH2)，7.2(苯基)絲氨酸NCA3.7(β-CH2)，4.4(α-CH)，5.8(NH)聚(O-芐基-DL-絲氨酸)向0.9g O-芐基-DL-絲氨酸NCA在2.5mlDMF的溶液中，添加0.08ml的2M的甲基胺在THF中的溶液。在室溫下攪拌數(shù)小時(shí)后，所述溶液變得渾濁和粘稠。在1天后，將所述粘稠的、“結(jié)晶化”溶液與甲醇/水混合以完全沉淀聚合產(chǎn)物。得到0.6g的聚合產(chǎn)物聚(O-芐基-DL-絲氨酸)。
在DMSO-d6中測(cè)定的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)芐基基團(tuán)4.4(CH2)，7.2(苯基)聚絲氨酸3.5(β-CH2)，4.7(α-CH)，8.2(NH)
聚(O-芐基-DL-絲氨酸)DODASuc將150mg N-丁二酰基-二-十八烷基胺(DODASuc)、80mgDCC和5mg DPTS溶解于4ml氯仿中。所述溶液在室溫下攪拌1小時(shí).添加0.6g聚(O-芐基-DL-絲氨酸)和約50μl的三乙胺在約5ml氯仿中的溶液。在室溫下攪拌過(guò)夜后，將該溶液(含有二環(huán)己基脲沉淀物)滴加到過(guò)量甲醇(約100ml)中。過(guò)濾出聚合產(chǎn)物并干燥。得到0.4g。
在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.6(CH2-N)芐基基團(tuán)4.4(CH2)，7.2(苯基)聚絲氨酸3.5(β-CH2)，4.7(α-CH)，8.2(NH)聚(DL-絲氨酸)DODASuc將0.1g聚(O-芐基-DL-絲氨酸)DODASuc溶解在約4ml 33％的HBr/AcOH溶液中并攪拌1小時(shí)。然后將所述溶液沉淀在水中。過(guò)濾出聚合產(chǎn)物，用水洗滌，收集并隨后溶解(1-2小時(shí))于4ml 1M NaOH中。用1N HCl溶液中和所得到的溶液，然后滲析(MWCO 500)數(shù)天。將滲析過(guò)的溶液冷凍干燥。得到20mg聚(DL-絲氨酸)DODASuc。
在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.6(CH2-N)聚絲氨酸3.6(β-CH2)，4.3(OH)，5.0(α-CH)，8.0(NH)從二硬脂基信號(hào)和α-CH信號(hào)的積分的比值，計(jì)算出聚絲氨酸分子量為約1500。
實(shí)施例14聚-L-蘇氨酸DODASuc
合成與聚(D，L-絲氨酸)DODASuc的合成相似，并由O-芐基-L-蘇氨酸、HCl和光氣開(kāi)始，經(jīng)過(guò)O-芐基-L-蘇氨酸N-羧基酸酐(NCA)進(jìn)行。
聚-L-蘇氨酸DODASuc(M＝約2000)在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.6(CH2-N)聚蘇氨酸1.0(CH3)，4.0(β-CH)，4.3(α-CH)，5.0(OH)，7.8(NH)實(shí)施例15聚(D，L-蛋氨酸亞砜)DODASucDL-蛋氨酸N-羧基酸酐(NCA)將2.5g DL-蛋氨酸在含有約15ml 20％光氣甲苯溶液的40ml蒸餾過(guò)的(干燥)THF中的懸浮液在60-65℃下加熱(氮?dú)饬鹘?jīng)過(guò)所述溶液)。幾乎立即形成澄清溶液。在約1小時(shí)后，將所述溶液緩慢傾倒在約140ml正己烷中。DL-蛋氨酸NCA在-20℃下結(jié)晶(需數(shù)天)。從乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶得到約0.7g結(jié)晶物質(zhì)。(Biopolymers 1976，15(9)1869-71)1H-NMR(CDCl3)(相對(duì)于溶劑峰的δ)蛋氨酸NCA2.0-2.4(β-CH2+CH3)，4.5(α-CH)，6.8(NH)聚(DL-蛋氨酸)向0.7g DL-蛋氨酸NCA在2.5mlDMF中的溶液中，添加0.1ml 2M的甲基胺THF溶液。在1天后，將渾濁溶液沉淀在約100ml甲醇中并隨后干燥。得到0.33g聚合產(chǎn)物聚(DL-蛋氨酸)。
在CDCl3/TF-d中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)聚蛋氨酸2.0-2.3(CH2&CH3)，2.6(CH2)，4.7(α-CH)聚(DL-蛋氨酸)DODASuc將80mg N-丁二?；?二-十八烷基胺(DODASuc)、45mgDCC和5mg DPTS溶解于2ml氯仿中。所述溶液在室溫下攪拌1小時(shí)。添加0.33g聚(DL-蛋氨酸)和約20μl三乙胺在約2.5mlDMSO中的溶液。在室溫下攪拌過(guò)夜后，將所述溶液(含有二環(huán)已基脲沉淀物)滴加到過(guò)量甲醇(約100ml)中。過(guò)濾出聚合產(chǎn)物并干燥。得到0.22g。
在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2-N)聚蛋氨酸1.8(β-CH2)，2.0(CH3)，2.4(γ-CH2)，4.4(α-CH)，8.1(NH)聚(DL-蛋氨酸亞砜)DODASuc聚(DL-蛋氨酸)DODASuc的單氧化將0.3g高碘酸鈉在2ml水中的溶液緩慢添加到0.22g聚(DL-蛋氨酸)二氨基丁烷DODASuc在約6ml乙酸中的懸浮液中。所得到的橙/紅色溶液(其在數(shù)小時(shí)后形成)攪拌1夜。然后添加約15ml水，并將所得到的橙/紅色溶液滲析(MWCO 500)數(shù)天。冷凍干燥后得到0.25g產(chǎn)物。
在D2O中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.7(CH3)，1.2(CH2)(寬峰)聚蛋氨酸亞砜2.0(β-CH2)，2.5(CH3)，2.8(γ-CH2)，4.3(α-CH)，8.5(NH)計(jì)算的分子量約4000。
實(shí)施例16聚(DL-谷氨酰胺)DODASucAnsynth Service B.V.使用固相肽合成方法(約50mg規(guī)模)合成了聚(DL-谷氨酰胺)DODASuc軛合物。結(jié)合到樹(shù)脂上的聚(DL-谷氨酰胺)(n＝20)使用Fmoc保護(hù)的氨基酸逐步構(gòu)造。向N-端上連接N-丁二?；?二硬脂基胺。將C-端轉(zhuǎn)變成酰胺。1H-NMR譜確認(rèn)了該結(jié)構(gòu)。
在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2-N)聚谷氨酰胺1.7-2.2(β，γ-CH2)，4.2(CH)，6.8&7.3(NH2)，8.2(NH) 實(shí)施例17聚(DL-天冬酰胺)DODASucAnsynth Service B.V.使用固相肽合成方法，由Fmoc保護(hù)的氨基酸開(kāi)始合成了聚(DL-天冬酰胺)DODASuc軛合物(約50mg規(guī)模)。逐步構(gòu)造結(jié)合到樹(shù)脂上的聚(DL-天冬酰胺)(n＝20)。向N-端上連接N-丁二?；?二硬脂基胺。將C-端轉(zhuǎn)變成酰胺。在DMSO中測(cè)定的1H-NMR譜確認(rèn)了所述結(jié)構(gòu)。
在DMSO-d6中的1H-NMR(相對(duì)于溶劑峰的δ)二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2-N)聚天冬酰胺2.5(CH2)，4.5(CH)，7.0&7.4(NH2)，8.1(NH) 實(shí)施例18
聚(D，L-丙氨酸)DODASuc將95mg聚-DL-丙氨酸(Sigma；MW約2000)溶解于4ml DMSO中。向該溶液中添加40μl三乙胺。隨后，將該溶液添加到0.1gDODASuc、70mgDCC和5mgDPTS在2ml氯仿中的已攪拌1小時(shí)的溶液中。在攪拌1天后，將該混合物沉淀在甲醇/乙醚混合物中。過(guò)濾出沉淀物并干燥。
在DMSO中測(cè)定的1H-NMR二硬脂基0.8(CH3)，1.2(CH2)，1.4(CH2N)聚丙氨酸1.2(CH3)，4.2(CH)，8.0(NH)實(shí)施例19β-丙氨酸和羥乙基L-谷氨酰胺的共聚肽DODASuc-(β-Ala)3-Glu(OBzD-(β-Ala)4-Glu(OBzl)-(β-Ala)3-Glu(OBzl)-(β-Ala)2-NH2Ansynth Service B.V.通過(guò)固相方法，由Fmoc保護(hù)的單體開(kāi)始合成了β-丙氨酸和L-谷氨酸芐基酯的共聚肽。
C-端酰胺；N-端DODASuc。
DODASuc-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)4-HEG-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)2-NH2之后，通過(guò)在DMF中進(jìn)行的氨解(乙醇胺)反應(yīng)將谷氨酸芐基酯單元轉(zhuǎn)化為羥乙基谷氨酰胺(HEG)單元。
在DMSO中測(cè)定的1H-NMR顯示不存在芐基基團(tuán)/芐基基團(tuán)的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例20制備含PHEG-硬脂胺的脂質(zhì)體稱(chēng)量33.8mg的蛋卵磷脂(EPC)(Lipoid Ludwigshafen)、9.67mg的膽固醇(Sigma Aldrich)和30.0mg的聚[N-(2-羥乙基)-L-谷氨酰胺]-硬脂胺(PHEG-硬脂胺)(合成的)并轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml圓底燒瓶中。添加500kBq的氚標(biāo)記的膽甾烯基油基醚作為類(lèi)脂標(biāo)記物。將所述類(lèi)脂和標(biāo)記物溶解于約10ml乙醇中。之后在40℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Rotavapor)中真空蒸發(fā)1小時(shí)，隨后經(jīng)氮?dú)獯祾?小時(shí)蒸發(fā)至干。
將PBS添加到所述干類(lèi)脂膜上，并在存在玻璃珠的條件下?lián)u動(dòng)一小時(shí)，以使類(lèi)脂膜完全水合。
將脂質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到擠出機(jī)(Avestin，最大體積15ml)中，并通過(guò)2個(gè)孔徑分別為200和100nm的聚碳酸酯過(guò)濾器(一個(gè)放在另一個(gè)上面)，使用氮?dú)饧訅簲D出6次，并通過(guò)孔徑分別為100nm和50nm的過(guò)濾器加壓擠出18次。隨后，將所述脂質(zhì)體懸浮液在滲析室(Slide-A-Lyzer，10000MWCO)中，在24小時(shí)內(nèi)對(duì)1升無(wú)菌PBS滲析2次。
通過(guò)光散射方法(Malvern Zeta-sizer)測(cè)定脂質(zhì)體的平均顆粒尺寸，并發(fā)現(xiàn)其為93.6±0.9nm，多分散性指數(shù)為0.099±0.02。在脂質(zhì)體制備過(guò)程中，通過(guò)將所述制劑的最終放射性與擠出步驟之前的放射性進(jìn)行對(duì)比來(lái)確定的類(lèi)脂的損失量為25％。脂質(zhì)體懸浮液在氮?dú)夥罩杏?℃下貯存。
實(shí)施例21含有其它類(lèi)脂-聚合物軛合物的脂質(zhì)體的制備使用在實(shí)施例20中所述的膜方法制備脂質(zhì)體。使用二棕櫚酰卵磷脂代替蛋卵磷脂。向干類(lèi)脂膜上添加5mM HEPES緩沖液，并在玻璃珠存在下?lián)u動(dòng)5分鐘，以使類(lèi)脂膜完全水合。通過(guò)經(jīng)孔徑為100和200nm的2個(gè)堆置的PC膜擠出12次來(lái)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行尺寸分級(jí)。將所得到的脂質(zhì)體分散體進(jìn)行滲析(MWCO 10000)，并使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)來(lái)確定平均顆粒尺寸。脂質(zhì)體制劑的性能見(jiàn)表1。
實(shí)施例22在給小鼠單次靜脈注射后結(jié)合到脂質(zhì)體中的3H-標(biāo)記的類(lèi)脂-聚合物軛合物的比較動(dòng)力學(xué)雄性小鼠(Wistar，Crl(WI)BR(outbred，SPF-Quality)(CharlesRiver，Sulzfeld，Germany))自由采食標(biāo)準(zhǔn)球粒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物餌料(Altromin，code VRF 1，Lage，Germany)和自來(lái)水。在尾部靜脈給予單劑量靜脈注射脂質(zhì)體制劑，各含有具有40-50kBq放射性的3H-標(biāo)記的膽甾烯基油基醚(Amersham)，(每50μmol類(lèi)脂的組成示于表1中)。除非另外指明，施用的總類(lèi)脂為5μmol。在給藥后的如下時(shí)間點(diǎn)從各小鼠的尾部靜脈收集血樣5分鐘和4、24和48小時(shí)。收集的血樣量為每次采樣約300μl。
將采集的血樣轉(zhuǎn)移到肝素化的管中并在-20℃下貯存。
按照如下方法將100μl的一個(gè)等分試樣增溶●將100μl轉(zhuǎn)移到閃爍管(20ml)中。
●添加100μl的Solvable。將其保溫至少1小時(shí)。
●添加100μl的1mM EDTA和200μl的H2O230％。該混合物在室溫下保溫24小時(shí)并之后在50℃下保溫過(guò)夜。
●添加Ultima Gold(10ml)作為閃爍流體(scintillation fluid)。
●通過(guò)LSC測(cè)量放射性。
所有放射性測(cè)量使用Packard閃爍計(jì)數(shù)儀(1900TR)來(lái)進(jìn)行。計(jì)數(shù)時(shí)間為達(dá)到±0.2％的統(tǒng)計(jì)精確度或最長(zhǎng)5分鐘，無(wú)論何者先達(dá)到。將Packard 1900TR編程以自動(dòng)地減去背景并將每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)轉(zhuǎn)化每分鐘的分解數(shù)(disintegration)。
對(duì)提到的一些制劑，在注射后48小時(shí)將小鼠的肝和脾解剖，按照如下方法評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的定位(localisation)將器官勻漿并將勻漿物稀釋至25ml(肝)或5ml(脾)。將1ml的均漿物轉(zhuǎn)移到閃爍管，隨后向其中添加●200ml Sovable(混合且將試樣在50℃下保溫過(guò)夜)●200ml 0.5M EDTA溶液●250ml H2O2(30％)溶液(在50℃下保溫過(guò)夜)●10ml Ultima Gold閃爍流體(渦旋且將試樣保溫24小時(shí))。
之后將試樣在β-閃爍計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)10分鐘。一些脂質(zhì)體制劑的結(jié)果示于圖6中。
按照實(shí)施例21制備的脂質(zhì)體制劑的組成和這一實(shí)施例的體內(nèi)試驗(yàn)得到的結(jié)果示于表1中。評(píng)價(jià)了血液循環(huán)時(shí)間的增加，其中●良好意味著對(duì)循環(huán)時(shí)間的作用與含有PEG-DSPE的脂質(zhì)體所顯示的作用相當(dāng)。
●適中意味著對(duì)循環(huán)時(shí)間的作用介于含有PEG-DSPE的脂質(zhì)體和無(wú)聚合物涂層的裸露脂質(zhì)體所顯示的作用之間。
●輕微意味著對(duì)循環(huán)時(shí)間的作用在目前條件下幾乎與裸露脂質(zhì)體所顯示的作用相似。
表1每50μmol類(lèi)脂的脂質(zhì)體組成和性能


*施用0.5μmol總類(lèi)脂(參見(jiàn)圖1和2)**施用0.05μmol總類(lèi)脂(參見(jiàn)圖1和2)***施用0.005μmol總類(lèi)脂(參見(jiàn)圖1和2)§當(dāng)在一周后進(jìn)行第二次注射時(shí)(TL1μmol)，對(duì)于含有實(shí)施例5.1的類(lèi)脂-聚合物軛合物的脂質(zhì)體，觀(guān)察到循環(huán)時(shí)間的減少。含有實(shí)施例11的軛合物的脂質(zhì)體也表現(xiàn)出這種減少，但對(duì)2個(gè)動(dòng)物，觀(guān)察到這種效應(yīng)適中。
實(shí)施例23制備含有類(lèi)脂-聚合物軛合物和強(qiáng)的松龍磷酸鹽的脂質(zhì)體分別稱(chēng)量 750mg的二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)(LipoidLudwigshafen)、220.0mg的膽固醇(Sigma Aldrich)和270.0mg的實(shí)施例11的類(lèi)脂-聚合物軛合物，及750mg的二棕櫚酰卵磷脂、250.8mg的膽固醇和267.6mg的PEG-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)(Avanti Polar Lipids)，并在100ml圓底燒瓶中混合。將類(lèi)脂溶解于約30ml的甲醇和氯仿的1∶1混合物(實(shí)施例14的類(lèi)脂-聚合物軛合物)或乙醇(PEG-DSPE)中。之后，在40℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Rotavapor)中真空蒸發(fā)1小時(shí)，隨后氮?dú)獯祾?小時(shí)而蒸發(fā)至干。
稱(chēng)量1200mg的強(qiáng)的松龍磷酸二鈉(PLP)(OPG Nieuwegein)并溶解于12ml的無(wú)菌PBS中。將該溶液添加到干類(lèi)脂膜上并在存在玻璃珠的條件下?lián)u動(dòng)一小時(shí)，以使類(lèi)脂膜完全水合。
將脂質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到擠出機(jī)(Avestin，最大體積15ml)中，并分別通過(guò)一個(gè)放在另一個(gè)上面的2個(gè)孔徑分別為200和100nm、分別為100和50nm及分別為50和50nm的多孔過(guò)濾器，使用氮?dú)饧訅簲D出6次。隨后，將所述脂質(zhì)體懸浮液在滲析室(Slide-A-Lyzer，10000MWCO)中，在24小時(shí)內(nèi)對(duì)1升無(wú)菌PBS滲析2次。
通過(guò)光散射方法(Malvern Zeta-sizer)測(cè)定脂質(zhì)體的平均顆粒尺寸，并發(fā)現(xiàn)其分別為約85和90nm，多分散性指數(shù)＜0.1。強(qiáng)的松龍磷酸鹽的包封效率通過(guò)HPLC方法來(lái)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其為2.6％。脂質(zhì)體懸浮液在氮?dú)夥罩杏?℃下貯存，發(fā)現(xiàn)其在至少5周內(nèi)是穩(wěn)定的，其中含有實(shí)施例14的類(lèi)脂-聚合物軛合物的脂質(zhì)體制劑略好于含有對(duì)比類(lèi)脂-聚合物軛合物PEG-DSPE的脂質(zhì)體制劑(參見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例24含有強(qiáng)的松龍磷酸鹽的脂質(zhì)體制劑在小鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型中循環(huán)時(shí)間和療效的評(píng)價(jià)用在不完全Freund’s佐劑(adjuvant)中加熱滅活的結(jié)核桿菌在尾底(tail base)對(duì)Lewis鼠進(jìn)行皮下免疫。在免疫后9至12天之間開(kāi)始爪炎癥，在約20天后達(dá)到最嚴(yán)重程度，然后逐漸消散。
從免疫后10天直到35天，通過(guò)對(duì)爪炎癥嚴(yán)重度進(jìn)行視覺(jué)打分來(lái)對(duì)所述疾病進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)爪炎癥分?jǐn)?shù)約達(dá)到最大分?jǐn)?shù)的一半數(shù)值時(shí)(14-15天)，將所有小鼠分為具有相等的平均分?jǐn)?shù)的5組，并用單一靜脈注射如下物質(zhì)來(lái)進(jìn)行處置1.在PHEA-DODASuc脂質(zhì)體中的10mg/kg PLP，如實(shí)施例23所制備，或2.在PEG-DSPE脂質(zhì)體中的10mg/kg PLP，如實(shí)施例23所制備(對(duì)比)，或3.PBS(空白)。
在t＝0、24和48小時(shí)，收集血樣并分析脂質(zhì)體PLP的血漿濃度。
PHEA-和PEG-脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)行為通過(guò)PLP的血漿濃度曲線(xiàn)來(lái)表示，其繪于圖4中。兩種類(lèi)型的脂質(zhì)體就循環(huán)半衰期而言表現(xiàn)同樣好。
圖5顯示了相對(duì)于作為空白實(shí)驗(yàn)的鹽水處置的小鼠，10mg/kgPLP-PHEA-和10mg/kg PLP-PEG-脂質(zhì)體在小鼠佐劑關(guān)節(jié)炎中的治療活性。
權(quán)利要求
1.一種類(lèi)脂-聚合物軛合物，其可從由至少一種憎水非極性部分和親水極性頭基團(tuán)組成的兩親性類(lèi)脂和一種具有N-和C-末端基團(tuán)的聚合物或其單體前體獲得，其特征在于，所述聚合物是聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)或聚(氨基酸類(lèi)似物)，且所述類(lèi)脂連接到所述聚合物的N或C末端基團(tuán)，所述聚合物具有如下通式-[NHCHR(CH2)mCO]n-其中-R定義為-H，-CH3，-CHCH3OR1，-(CH2)xOR1，-(CH2)x-CO-NHR1，-(CH2)xNH-CO-R1，-(CH2)x-SOyCH3，OR-(CH2)xCOOH；-R1為H或(C1-C4)烷基，由一個(gè)或多個(gè)羥基或一個(gè)二(C1-C4)烷基氨基取代；x為0-4；m＝1或0，和y＝1或2。
2.權(quán)利要求1的軛合物，其特征在于，所述兩親性類(lèi)脂選自磷脂，糖脂，神經(jīng)酰胺，膽固醇和衍生物，飽和或不飽和的、支鏈或直鏈C8-C100單-或二-烷基胺，芳基烷基胺，環(huán)烷基烷基胺，鏈烷醇，醛，碳鹵或鏈烷酸和它們的酸酐，并且其特征在于C原子總數(shù)為25或更高。
3.權(quán)利要求2的軛合物，其特征在于，所述兩親性類(lèi)脂含有至少兩個(gè)憎水非極性部分。
4.權(quán)利要求3的軛合物，其特征在于，所述兩親性類(lèi)脂選自1-十七烷基十八烷基胺、N-琥珀酰-二-十八烷基胺和二硬脂基磷脂酰乙醇胺。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的軛合物，其特征在于，所述聚合物具有的在水中的χ-參數(shù)≤0.65，優(yōu)選≤0.5。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的軛合物，其特征在于，所述聚合物由α-氨基酸和其衍生物或類(lèi)似物組成。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的軛合物，其特征在于，在4-8的生理pH范圍內(nèi)，所述聚合物不含有顯著數(shù)量的荷電基團(tuán)。
8.權(quán)利要求7的軛合物，其特征在于，所述聚合物由中性或已中和的在4-8的生理pH的氨基酸單體、氨基酸類(lèi)似物單體或氨基酸衍生物單體組成。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的軛合物，其特征在于，所述聚合物的分子量為500至75000，優(yōu)選2000至15000。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的軛合物，其特征在于，所述聚合物是可生物降解的。
11.權(quán)利要求1的軛合物，其特征在于，所述聚合物是聚[N-(2-羥乙基)]-L-谷氨酰胺。
12.權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，所述聚合物是聚(2-羥乙基)-L-天冬酰胺。
13.權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，所述聚合物是聚(D，L-蛋氨酸亞砜)。
全文摘要
本發(fā)明提供了聚(氨基酸)、聚(氨基酸衍生物)或聚(氨基酸類(lèi)似物)如聚[N－(2－羥乙基)－谷氨酰胺](PHEG)的類(lèi)脂軛合物。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1602326SQ02812734
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者J·M·麥特瑟拉, W·E·翰尼克, T·德溫格爾, L·W·T·德博爾, C·歐瑟倫, G·斯托姆, P·布魯恩 申請(qǐng)人:山之內(nèi)歐洲有限公司