專利名稱：EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于含有兩個或多個單核苷酸單元的化合物領(lǐng)域，特別是涉及具有以核苷基的糖化物基團連接的單獨的磷酸酯基或多磷酸酯基的化合物。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是我國南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤，是頭頸部腫瘤中復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率最高的疾病，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達80%，治愈后5年內(nèi)仍有20 30%患者出現(xiàn)鼻咽癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，是臨床上導致死亡的主要因素之一，傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、放療或化療等對防治鼻咽癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移效果不理想，相比較而言，應(yīng)用生物治療方法更適合第二階段的治療，其中基因療法對防治鼻咽癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移具有更重要的臨床意義。EB病毒(Epstein Barr virus, EBV)是一種Y皰疹病毒,幾乎所有的未分化和低分化鼻咽癌都與EB病毒潛伏性感染有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)EB病毒編碼的miRNA可參與調(diào)控EB病毒編碼的基因和人宿主基因的表達EBV-miR-BART2能與編碼病毒DNA聚合酶的基因BALF5的3—UTR完全互補。在裂解感染期大量病毒復制時，miR_BART2表達水平降低，對 BALF5基因的分解作用減弱，有利于病毒復制循環(huán)。隨著miR-BART2選擇壓力變化，BALF5 表達降低，EBV感染細胞釋放的病毒顆粒不斷減少，感染進入潛伏狀態(tài)(Nucleic Acids Res 37 :1035-48,2009) ；EBV-miR-BHRFI-3 與細胞 IFN 誘導的 T 細胞趨化因子 CSX-11/ I-TAC的表達水平相關(guān)，推測CXCL-11/1-TAC是miR-BHRF1 _3作用靶點，EB病毒可以此作為調(diào)節(jié)方式來干擾宿主的免疫監(jiān)視和免疫清除作用(Cancer Res 68 1436-42，2008)； EBV-miR-BART5能通過抑制宿主的凋亡前蛋白PUMAHl，上調(diào)P53的表達。如果從EBV感染的細胞中去除miR-BART5，將促進PUMA介導的凋亡作用，提示EBV能夠抑制凋亡的發(fā)生，從而保護其感染的上皮細胞(J Exp Med 205 :2551-60,2008，J Biol Chem 285 =33358-70, 2010) ；miR-BART6-5p能抑制EBNA2病毒癌基因的表達，而這種癌基因的表達在I型和II型潛伏狀態(tài)(免疫低反應(yīng))向III型潛伏狀態(tài)(免疫高反應(yīng))轉(zhuǎn)化的過程中是不可缺少的， 表明miR-BART6在EBV的感染和潛伏中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用(J Biol Chem 285 =33358-70, 2010)。由此可見，EB病毒miRNA —方面可作用于病毒本身的靶基因，促進病毒的感染和潛伏，另一方面也可以作用于宿主的靶基因，促進病毒逃避宿主細胞的免疫反應(yīng)，并抑制宿主細胞的凋亡。然而，有關(guān)EB病毒miR_BART3的作用及機制的研究卻很少，Lo等(PNAS 104 16164-9，2007)報道 3 種 EB 病毒編碼的 miRNA (miR-BARTl_5p，miR-BART16 和 miR-BART 17-5p)可下調(diào)EB病毒的LMPl基因的表達。當LMPl受到病毒miRNA調(diào)控時，其下游信號途徑會受到抑制，NF-KB表達降低，凋亡受到抑制，使EB病毒感染的細胞易向腫瘤發(fā)展(Cell Mol Immunol 4 :185-96,2007) 另有報道 EBV-miR-BARTl 可與 BBLF4 和 LMP2A mRNA 3，端結(jié)合，從而達到調(diào)節(jié)病毒自身基因表達的目的(PNAS，1993，90 :378-382)。重要的是，迄今為止，有關(guān)EB病毒miR-BART3與其他EB病毒miRNA促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展尤其是促鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用仍未見任何報道。納米顆粒具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等優(yōu)勢，通過增強滲透和保留作用 (EPR)可有效地靶向腫瘤區(qū)域，近年來研究納米載藥系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤治療成為熱點 (Biomacromolecules. 11，3531-3538，2010)。納米顆粒可包裹、濃縮、保護核苷酸，使其免受核酸酶降解；通過表面功能化，可連接特異靶向分子；體內(nèi)循環(huán)時間明顯長于普通大小顆粒，IOOnm以下的納米顆粒能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而延長給藥時間，提高給藥效果；合適的納米基因藥物既能夠發(fā)揮陽離子聚合物的體外高效轉(zhuǎn)染的優(yōu)點，也可以有效避免體內(nèi)實驗過程中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，提高治療效果，因此將納米技術(shù)應(yīng)用于基因治療具有很好的臨床應(yīng)用前景。粒徑為Inm 150nm的金顆粒(AuNP)為惰性物質(zhì)，無毒，制備方法簡單，成本較低，具有特殊的光學性質(zhì)以及良好的生物相容性和表面易于功能化等優(yōu)點，可與藥物分子、生物大分子等結(jié)合，廣泛地應(yīng)用于免疫標記、生物芯片、生物傳感及藥物輸送系統(tǒng)等生物醫(yī)學領(lǐng)域(Adv. Drug Deliv. Rev. 60，1307-1315，2008)。近年來以金納米顆粒為載體，表面進行適當功能化的基團修飾，再進一步負載AMO、siRNA等進行基因治療獲得了許多可喜的成果。美國西北大學研究團隊，應(yīng)用13nm左右金顆粒穩(wěn)定多股巰基化寡核苷酸，使其進細胞能力大大增強，可綁定到目標信使的核酸(mRNAs)使其表達下調(diào)，并具有抗核酸酶性質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高于未經(jīng)過修飾的寡核苷酸及商品用轉(zhuǎn)染脂質(zhì)載體 Lipofectamine2000 (Science. 312，27-30，2006) ；Klibavov 小組將帶有低分子量 PEI (2KDa)的金納米顆粒作為載體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA進猴腎細胞C0S-7，既增加了 PEI的有效分子量又降低了其細胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較單一的PEI增加了 12倍(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(16) :9138-9143,2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途，體現(xiàn)該用途的藥物可以有效地與EB病毒miR-BART3結(jié)合，阻斷miR_BART3的表達及其對鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控促進作用，從而達到抗鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移和治療鼻咽癌的目的。上述EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途具體是，EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸在制備抗鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是 ACACCUG⑶GACUA⑶GGUGCG (SEQ ID NO :1)。本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成，如，先采用核酸合成儀合成，再經(jīng)簡單的單鏈化學修飾(如，2’-甲氧修飾，變成增強型寡核苷酸)和HPLC純化制得。本發(fā)明人推薦的方法由以下步驟組成1.反義寡核苷酸探針的設(shè)計(1. 1)根據(jù)國際公用的Sanger mirtase數(shù)據(jù)庫中的EB病毒miR_BART3序列，進行反義設(shè)計，獲得反義寡核苷酸序列；其中探針設(shè)計的基本原則是，1)探針內(nèi)部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不超過2個；2)經(jīng)BLAST比較與其它序列的相似性小于20%;3)經(jīng)BLAST比較與其它基因序列的重復連續(xù)不超過3個堿基；(1. 2)采用21-23 nt -甲氧修飾，得到SEQ ID NO 1所示序列；2.反義寡核苷酸探針的合成及純化(2. 1)將SEQ ID NO 1所示的序列輸入3900合成儀自動合成，得到含SEQ ID NO 1所示序列的反義寡核苷酸的合成柱；(2. 2)對合成柱進行洗脫并收集洗脫液，然后，冰凍、干燥、去氨水，溶于9 1的甲酞胺和TBE混合溶液中；(2. 3)上樣于HPLC進行純化；(2.4)酒精沉淀、洗滌、真空抽干后得到序列為SEQ ID N0:1的反義寡核苷酸，-20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)移和侵襲試驗(Transwell實驗和Boyden小室實驗)分析發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細胞中呈高度表達的EB病毒miR-BART3能明顯促進鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。將 EB病毒編碼的miR-BART3轉(zhuǎn)染進鼻咽癌細胞株CNEl后，與沒有轉(zhuǎn)染EB病毒miR_BART3的 CNEl細胞株相比較，細胞穿透濾膜和基質(zhì)膜的數(shù)量顯著增多，表明該miRNA調(diào)控促進了鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。本發(fā)明人將EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸作用鼻咽癌細胞后，EB病毒 miR-BART3表達水平發(fā)生顯著性差異變化(ffelch/F = 104. 400，P = O. 000, 24h和48h干擾抑制效率均可達到80%以上(表明其反義抑制作用至少能維持兩天)，表明經(jīng)EB病毒 miR-BART3反義寡聚核苷酸作用的鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力出現(xiàn)明顯降低，穿過透濾膜和基質(zhì)膜的數(shù)量明顯減少。本發(fā)明所述的治療鼻咽癌的藥物由EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸和藥學上可以接受的賦形劑組成。為了提高藥效，最好是先將EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸吸附在納米球上， 然后再加入適當?shù)馁x形劑制成所需要的劑型。本發(fā)明所述的納米球的粒徑為30nm 50nm，該納米球由含巰基的納米金、分子量為Ida的聚乙烯亞胺、反義寡核苷酸與聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物組成；所述的納米球可以由以下方法制備得到(a)將含巰基的納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金10倍的分子量為Ida的聚乙烯亞胺加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到聚乙烯亞胺包裹納米(b)將步驟(a)制備的聚乙烯亞胺包裹納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金80倍的序列為SEQ ID NO :1的反義寡聚核苷酸加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到負載反義寡核苷酸納米金；(c)將步驟(b)制備的負載反義寡核苷酸納米金、質(zhì)量為含巰基的納米金6倍的聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到納米球其中，聚乙二醇單甲醚的分子量為觀叔，支鏈型聚乙烯亞胺的分子量為25Kda，且聚乙二醇單甲醚與支鏈型聚乙烯亞胺的物質(zhì)的量之比為1 1.5。上述納米球的制備方法中，所述的共聚物的制備方法可參照文獻的報導(如 Macromolecules,35，6867-6874，2002)。上述納米球的制備方法中，所述的含巰基的納米金的粒徑為15 20nm。其中， 所述的含巰基的納米金可以依據(jù)本領(lǐng)域常用的方法制備，具體步驟可以參照文獻的報導 (如ACS Nano, 4 (9) :5505-5511，2010)。本發(fā)明所述的反義寡核苷酸可阻斷EB病毒編碼的miRNA的復制、生存和表達，其堿基序列與反向互補的序列結(jié)合，具有比抗體更高的專一性，使鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移受到有效抑制，且miRNA無免疫原性，有利于更好地防治鼻咽癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。更進一步地，本發(fā)明將所述的反義寡核苷酸制備成納米基因藥物，以保護反義寡核苷酸免受核酸酶降解，延長作用時間，比商品用脂質(zhì)體有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進一步的臨床實際開發(fā)和應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明所述的EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸Transwell轉(zhuǎn)移實驗的直方圖，圖中Control為未加反義寡核苷酸的鼻咽癌細胞株Transwell轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果， BART3-AM0是反義寡核苷酸作用后的鼻咽癌細胞株Transwell轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果。圖2是本發(fā)明所述的EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸Boyden小室侵襲實驗直方圖，圖中Control為未加反義寡核苷酸的鼻咽癌細胞株Boyden小室侵襲實驗結(jié)果， BART3-AM0是反義寡核苷酸作用后的鼻咽癌細胞株Boyden小室侵襲實驗結(jié)果。
具體實施例方式實施例11、含有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌細胞株CNEl的制備；細胞CNEl細胞株購自湖南中南大學湘雅醫(yī)學院中心實驗室。過表達miR-BART3的CNEl細胞制備化學合成EB病毒miR_BART3前體分子序列 (282bp)，連接到含GFP表達的慢病毒載體pMAGic 4. O中，經(jīng)pNL_EGFP/CMV/WPREDU3載體質(zhì)粒、pCD/NL-BH*DDD包裝質(zhì)粒和pLTR-G質(zhì)粒，在細胞中的包裝，產(chǎn)生能表達EB病毒 miR-BART7的慢病毒載體pMAGic_EB病毒miR_BART3。用此慢病毒載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株 CNE1，經(jīng)流式分篩，定量PCR證實，獲得EB病毒miR_BART3穩(wěn)定高表達的CNEl (含GFP表達)。具體步驟可以參照文獻(南方醫(yī)科大學學報2011 ；31 (3) :419)。寡核苷酸EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的序列為SEQ ID NO :1，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。另外，對于EB病毒編碼的miR_BART3及其反義寡核苷酸的生物活性實驗，均用商品化脂質(zhì)體LipofectamindOOO為載體進行轉(zhuǎn)染。EB病毒miR-BART3反義寡核苷酸抑制EB病毒miR_BART3活性的測定方法(1)細胞轉(zhuǎn)染取單層過表達miR_BART3的鼻咽癌細胞株，以不含抗生素的10% 小牛血清完全培養(yǎng)基(PBR1640或DMEM)培養(yǎng)接種于6孔板，37°C，5 %的CO2孵育過夜，次日，每孔用無血清培基稀釋lipofectamine 2000，室溫孵育5min，同時用無血清培基稀釋 EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸，混合稀釋的lipofectamine 2000和稀釋的EB病毒 miR-BART3反義寡聚核苷酸，室溫下放置20min，6孔板細胞移去培基后，沖洗2次，加入2mL 無血清培基后，將混合液加入每孔中輕輕混勻，37 °C，5%的C02培養(yǎng)箱孵育他后，更換含有 10 %小牛血清全培養(yǎng)基，應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同時間的轉(zhuǎn)染水平。(2)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染水平所有用于RNA制備的器皿均經(jīng)去RNase處理，所需液體均用滅活的DEPC水配制。細胞總RNA的抽提按照TRIzol試劑說明書進行。取對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞株培養(yǎng)至細胞待測密度，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入ImL TRIzoUKi靜置5min后裂解液轉(zhuǎn)移至1. 5mL EP管，加入氯仿0. 2mL,劇烈振搖15sec，室溫放置5分鐘后12000rpm 4oC離心15min，吸出上層水相，下層轉(zhuǎn)移至另一 1. 5ml EP管，按等比例加入異丙醇，混勻后室溫靜置5min，離心30min，75%乙醇洗滌沉淀，離心10分鐘，下層在超凈臺中自然干燥5-lOmin，待酒精揮發(fā)后用適量DEPC水溶解，-80°C保存?zhèn)溆?。RNA標本稀釋后測定A260和A280，計算RNA濃度和純度，在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測RNA有無降解。檢測完好的RNA用于進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照TIANkript cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA的合成。應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同時間的轉(zhuǎn)染水平。2、EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抗鼻咽癌細胞侵襲的實驗；用matrigel在Transwell上室制備人工基底膜，轉(zhuǎn)染前后各組細胞用無血清培基稀釋成密度為ι χ 106/ml的細胞懸液，100 μ L細胞懸液加入Transwell上室，下室加600 μ L 條件培養(yǎng)液，370C 5%,CO2培養(yǎng)箱孵育3 后，取出Transwell小室，吸棄液體，用棉簽擦凈基底膜膠，PBS漂洗后甲醛固定30min，蘇木精染色。鏡下計數(shù)(平均計數(shù)4個視野)，以上實驗獨立重復3次。結(jié)果如圖1所示。圖1表明，與帶有EB病毒-miR-BARTl-5p的鼻咽癌細胞株相比較，經(jīng)EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸作用后的細胞，細胞穿透濾膜數(shù)量減少，具有顯著差異(P < 0. 0000)，說明EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸抑制了鼻咽癌細胞的遷移。3、EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抑制鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移的實驗。與Transwel 1侵襲實驗相同，只是Transwel 1上室不需用人工基底膜覆蓋，實驗獨立反復3次。結(jié)果如圖2所示。圖2表明，與帶有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌細胞株比較， 經(jīng)EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸作用后的細胞，細胞穿透基質(zhì)膜數(shù)量減少，具有顯著差異(P < 0. 0000)，說明EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸抑制了鼻咽癌細胞的侵襲。從圖1和圖2可以知道EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抑制了鼻咽癌細胞的遷移和侵襲，具有治療鼻咽癌效果。實施例21.納米球的制備1. 1制備聚乙烯亞胺包裹納米金將含巰基的納米金加入濃度為ImM的NaCl溶液，調(diào)整納米金濃度為0. lmg/mL ；向反應(yīng)液中加入聚乙烯亞胺(PEI，Mw = 2k)至聚乙烯亞胺濃度為1. Omg/mL，常溫反應(yīng)30分鐘，用157500xg離心10分鐘，重復2次，制備得到聚乙烯亞胺包裹金納米；將聚乙烯亞胺包裹納米金重懸于濃度為IOmM的NaCl溶液，得到0. lmg/mL聚乙烯亞胺包裹納米金NaCl溶液，待用；其中含巰基的納米金可以依據(jù)以下方法制備得到取IOOmL氯金酸水溶液(0. 01 ，加熱至沸，攪拌下準確加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在5分鐘內(nèi)變?yōu)槌燃t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后，用220nm 的濾膜除去大粒子，用蒸餾水恢復到原體積；取新制備的金溶膠溶液用IN的NaOH溶液調(diào)整PH值為11，加入11-巰基十一烷酸至終濃度為0. lmg/mL，常溫攪拌過夜，用離心轉(zhuǎn)速 157500xg離心10分鐘，重復2次，得到含巰基納米金。經(jīng)TEM檢測含巰基的納米金粒徑為 15 20nmo1.2.制備負載反義寡核苷酸的納米金
取0. lmg/mL聚乙烯亞胺包裹納米金NaCl溶液5. 5mL，加入序列為SEQ ID NO 1的 EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸4. Omg,常溫下攪拌30分鐘，用157500xg離心10分鐘， 重復2次，得到負載反義寡核苷酸金納米。將負載反義寡核苷酸納米金重懸于濃度為IOmM 的NaCl溶液，得到0. lmg/mL負載反義寡核苷酸納米金NaCl溶液，待用；1. 3.制備納米球取0. lmg/mL負載反義寡核苷酸納米金NaCl溶液10mL，加入分子量為Ida的聚乙二醇單甲醚3. 3mg和分子量為2漲叔的支鏈型聚乙烯亞胺62. 6mg，常溫反應(yīng)30分鐘，用 157500xg離心10分鐘，重復2次，得到納米球。將納米球加入濃度為IOmM的NaCl溶液，密封保存。2.納米球性能檢測應(yīng)用紫外光分光光度計測定納米球在51911111和^Onm處的顯示吸收峰。其中， 519nm處吸收峰是納米金的特征吸收峰；260nm處吸收峰是核酸特征吸收峰。利用透射電鏡(TEM)觀察負載藥物納米球，粒徑為30 50nm。3.抑制鼻咽癌細胞中EB病毒-miR_BART3效果序列SEQ ID NO 1的反義寡核苷酸及負載該反義寡核苷酸納米球抑制鼻咽癌細胞 CNEl中EB病毒-miR-BART3的表達及有效作用時間3. 1納米球抑制鼻咽癌細胞中EB病毒miR_BART3實驗取單層過表達miR_BART3的鼻咽癌CNEl細胞株，以不含抗生素的10%小牛血清 PBR1640培養(yǎng)基培養(yǎng)接種于6孔板，37°C，5 %的C02孵育過夜，次日，6孔板細胞移去培基后，沖洗2次，每孔加入2mL用無血清培基稀釋載有反義寡核苷酸納米球(含有反義寡核苷酸5nmol)，輕輕混勻，37°C，5 %的C02培養(yǎng)箱孵育Mi后，更換含有10 %小牛血清全培養(yǎng)基。 同時，將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染EB病毒miR_BART3反義寡核苷酸作為對照樣，未轉(zhuǎn)染EB 病毒miR-BART3反義寡核苷酸的細胞作為空白樣，進行對比實驗。在整個實驗過程中，分別收集轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h和4 時的細胞。3. 2.應(yīng)用熒光定量PCR檢測對EB病毒miR_BART3的抑制效果和有效作用時間3. 2. 1對收集的細胞分別進行總RNA抽提取對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞株培養(yǎng)至細胞待測密度，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入lmLTRIzol，冰上靜置5min后裂解液轉(zhuǎn)移至1. 5mL EP管，加入氯仿0. 2mL,劇烈振搖 15sec，室溫放置5分鐘后12000rpm 4°C下離心15min，吸出上層水相，下層轉(zhuǎn)移至另一 1. 5ml EP管，加入等比例異丙醇，混勻后室溫靜置5min，離心30min，75%乙醇洗滌沉淀，離心10分鐘，下層在超凈臺中自然干燥5 lOmin，待乙醇揮發(fā)后用DEPC水溶解得到總抽提 RNA, -80°C保存?zhèn)溆??？偝樘酭NA標本稀釋后測定A260和A280，計算RNA濃度和純度，在 1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測總抽提RNA有無降解。3. 2. 2.熒光定量PCR檢測冊病毒miR_BART3的表達3.2.2. 1.依照 TaqMan MiRNA Reverse Transcription Kit 說明書，對總抽提 RNA 標本進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA(a)在 DEPC 水處理過的 EP 管中先加入 10XRT buffer 1. 5μ 1, dNTP 0·15μ1、 RNaseInhibitor 0· 19 μ 1、RT enzyme 1 μ 1 ；再力口入 3 μ 1 特異性 RT primer、5 μ 1 總抽提 RNA標本，輕輕混勻。
權(quán)利要求
1.EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是ACACCUG⑶GACUA⑶GGUGCG (SEQ ID NO :1)。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是先將所述反義寡聚核苷酸負載到納米金上制成納米球，再加入藥學上可以接受的輔料制成。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的納米球的粒徑為30nm 50nm，該納米球由含巰基的納米金、分子量為^ida的聚乙烯亞胺、反義寡核苷酸與聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物組成；所述的納米球可以由以下方法制備得到(a)將含巰基的納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金10倍的分子量為Ida的聚乙烯亞胺加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到聚乙烯亞胺包裹納米金；(b)將步驟(a)制備的聚乙烯亞胺包裹納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金80倍的序列為 SEQ ID NO :1的反義寡聚核苷酸加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到負載反義寡核苷酸納米金；(c)將步驟(b)制備的負載反義寡核苷酸納米金、質(zhì)量為含巰基的納米金6倍的聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到納米球；其中，聚乙二醇單甲醚的分子量為觀叔，支鏈型聚乙烯亞胺的分子量為25Kda，且聚乙二醇單甲醚與支鏈型聚乙烯亞胺的物質(zhì)的量之比為1 1.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途，具體涉及EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是ACACCUGGUGACUAGUGGUGCG(SEQ ID NO1)。本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸可以有效地與EB病毒成熟miRNA結(jié)合，阻斷miRNA的表達及其相應(yīng)的調(diào)控作用，從而抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且miRNA無免疫原性，有利于進一步應(yīng)用于防治鼻咽癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。體現(xiàn)本發(fā)明所述用途的藥物，可保護反義寡核苷酸免受核酸酶降解，延長作用時間，比商品用脂質(zhì)體有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進一步的臨床實際開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102188719SQ201110122249
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者葉艷芬, 李欣, 王鶯, 蔡紅兵 申請人:南方醫(yī)科大學