專利名稱：：經(jīng)細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞在體外和體內(nèi)將藥物靶向遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及實(shí)現(xiàn)受控的藥物釋放和藥物靶向特定組織的持續(xù)努力，尤其是癌癥化療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及在體內(nèi)和體外通過(guò)完整的細(xì)菌微細(xì)胞來(lái)靶向藥物遞送至期望的靶細(xì)胞內(nèi)，其中所述細(xì)菌微細(xì)胞能細(xì)胞內(nèi)遞送藥物。包含化學(xué)或生化藥物的微細(xì)胞構(gòu)成新的遞送載體，能靶向特定的細(xì)胞。使這些載體靶向的一種方法使用雙特異性分子，其能特異性結(jié)合微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和靶細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，例如受體。該雙特異性配體介導(dǎo)微細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的相互作用，使得靶細(xì)胞吞入微細(xì)胞，而微細(xì)胞釋放它們的藥物載荷進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。一旦藥物在細(xì)胞質(zhì)釋放，其將作用于細(xì)胞內(nèi)靶，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、酶和輔助因子，從而實(shí)現(xiàn)治療作用。在藥物遞送的另一種方法中，具有吞噬作用或內(nèi)吞作用的靶細(xì)胞吞入載有藥物的微細(xì)胞，而不使用雙特異性配體。
背景技術(shù)：
：目前，用于治療癌癥的大多數(shù)藥物是系統(tǒng)性給藥。盡管細(xì)胞毒性抗癌藥物的系統(tǒng)性遞送在癌癥治療中起關(guān)鍵性作用，但是其也產(chǎn)生了嚴(yán)重的問(wèn)題。例如，正常組織/器官系統(tǒng)性暴露于所施用藥物可引起嚴(yán)重毒性(SarosyandReed,1993)0這又被以下事實(shí)進(jìn)一步惡化為了克服藥物的生物利用度差和患者內(nèi)大體積分布，系統(tǒng)性遞送的癌癥化療藥物經(jīng)常必須以很高劑量遞送。而且，系統(tǒng)性給藥可以是侵入性的，其經(jīng)常需要在大血管中使用保護(hù)導(dǎo)管。因?yàn)橄到y(tǒng)性給藥通常需要使用外周或中樞靜脈，其可引起局部并發(fā)癥，例如靜脈炎。藥物的外滲也可導(dǎo)致給藥的局部部位的起皰/組織損傷。這種情況在施用長(zhǎng)春花屬生物堿和蒽環(huán)類藥物時(shí)是常見(jiàn)的。因?yàn)楝F(xiàn)有的靶向藥物遞送系統(tǒng)有嚴(yán)重缺陷，當(dāng)前癌癥藥物治療策略難于解決系統(tǒng)性給藥存在的問(wèn)題。解決這些問(wèn)題的一種方法涉及簡(jiǎn)單地修改給藥時(shí)間表或輸注方案，其可以是快速濃注、間斷或連續(xù)給藥。然而，該方法提供了非常有限的益處。也存在靜脈注射的一些替代方法，每種都旨在提供區(qū)域性遞送，即選擇性遞送至腫瘤區(qū)域。這些替代方法的實(shí)例包括聚合物植入物、腹膜內(nèi)輸注、胸膜內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)遞送、化學(xué)栓塞和氣霧劑吸入。特別地，化療的腹膜內(nèi)施用已經(jīng)廣泛地研究用于卵巢癌和其它腹部腫瘤(Kirmanietal.,1994；Albertsetal.，1996)。不幸的是，這些遞送方法中的每種，包括腹膜內(nèi)給藥，在選擇性遞送藥物至腫瘤部位和降低副作用方面都僅獲得及其有限的成功。解決系統(tǒng)性遞送細(xì)胞毒性抗癌藥物問(wèn)題的其它嘗試包括，使用替代性藥物制劑和遞送系統(tǒng)，包括控釋生物降解聚合物、聚合物微球載體和脂質(zhì)體，以及與抗腫瘤藥一起施用細(xì)胞保護(hù)劑。ChonnandCullis,1995；Kempetal.,1996；Kumanohosoetal.，1997；Schilleretal.,1996；Sharmaetal.,1996；Siposetal.,1997。使用脂質(zhì)體作為化療劑的藥物載體，原本是建議將其作為控制藥物分布以改善抗腫瘤功效和降低毒性的方法(綜述見(jiàn)Allen，1997)。通過(guò)將藥物在高分子載體如脂質(zhì)體中3包囊化，藥物的分布體積顯著降低，腫瘤中藥物濃度增加。這引起非特異性毒性的量和類型的減少、可有效遞送至腫瘤的藥物量增加(PapahadjopoulosandGabizon,1995；GabizonandMartin,1997；Martin,1998)0脂質(zhì)體保護(hù)藥物不被代謝和在血漿中滅活。而且，由于跨健康內(nèi)皮運(yùn)輸大分子或載體的大小限制，藥物在健康組織中的累積程度降低(Mayeretal.，1989；Workingetal.，1994)。為了延長(zhǎng)它們的循環(huán)時(shí)間，用聚乙二醇(PEG)、合成的親水性聚合物包裹脂質(zhì)體(WoodleandLasic，1992)。PEG的頭基(headgroup)可用作屏障，空間上抑制在脂質(zhì)體表面處與多種血液組分和血漿調(diào)理素的疏水和靜電相互作用，因而阻礙了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別脂質(zhì)體。PEG-包被的脂質(zhì)體被稱為“空間穩(wěn)定化的”(SSL)或STEALTH脂質(zhì)體(LasicandMartin,1995)0這一技術(shù)產(chǎn)生了聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素的商品化藥物制劑，在美國(guó)稱為Doxil，在歐洲稱為Caelyx。大量的其它藥物也已經(jīng)被包囊入脂質(zhì)體用于癌癥治療(Heathetal.,1983；Papahadjopoulosetal.,1991；Allenetal.,1992；Vaageetal.,1993b；BurkeandGao,1994；Sharmaetal.,1995；Jonesetal.,1997；Working,1998)。不幸地是，脂質(zhì)體藥物載體有幾個(gè)缺點(diǎn)。例如，在體內(nèi)，藥物經(jīng)常以足以生物利用的速率滲漏出脂質(zhì)體外，引起對(duì)正常組織的毒性。類似地，脂質(zhì)體在體內(nèi)不穩(wěn)定，它們的破裂釋放藥物并引起對(duì)正常組織的毒性。而且，因?yàn)橛H水性藥物具有非常低的膜滲透性，高親水性藥物的脂質(zhì)體制劑可以在腫瘤位點(diǎn)具有足以禁止性的低生物利用度。當(dāng)脂質(zhì)體載體到達(dá)腫瘤，這限制了藥物釋放。此外，高疏水性藥物傾向于主要與脂質(zhì)體的雙層部分結(jié)合，由于藥物向血漿組分中的快速再分配，引起包埋穩(wěn)定性較低。另外，一些藥物，如Ι-β-D-阿糖呋喃糖苷胞噻啶(ara-C)和甲氨蝶呤，僅經(jīng)膜運(yùn)輸載體(transporter)直接進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(Plagemanetal.，1978；Wileyetal.，1982；Westerhofetal.，1991，1995；Antony,1992)。在這種情況下，脂質(zhì)體載體將需要在腫瘤部位附近釋放足量的藥物以獲得治療效果(Heathetal.，1983；Matthayetal.，1989；Allenetal.，1992)。最近，使用常規(guī)脂質(zhì)體制劑增加患者獲得機(jī)會(huì)感染的風(fēng)險(xiǎn)(White，1997)，這是因?yàn)樗幬镌诰W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞中的定位和伴隨的巨噬細(xì)胞毒性(Allenetal.，1984；Daemenetal.，1995，1997)。這一問(wèn)題在免疫缺陷患者如治療卡波西肉瘤的AIDS患者中被加劇。因?yàn)檫@些問(wèn)題繼續(xù)顯著地阻礙癌癥治療的成功，迫切需要靶向藥物遞送策略，其或者選擇性遞送藥物至腫瘤細(xì)胞和靶器官，或者保護(hù)正常組織免于所施用的抗腫瘤藥劑。這樣的策略將通過(guò)增加抗癌劑的治療指數(shù)來(lái)提高藥物治療的功效，同時(shí)最小化藥物相關(guān)毒性的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB02/04632已經(jīng)描述了包含治療性核酸分子的重組的、完整微細(xì)胞。這樣的微細(xì)胞是體外和體內(nèi)向宿主細(xì)胞遞送寡核苷酸和多核苷酸的有效載體。PCT/IB02/04632中提供的數(shù)據(jù)證實(shí)，例如，載有哺乳動(dòng)物基因表達(dá)質(zhì)粒的重組微細(xì)胞可被遞送至吞噬性細(xì)胞和非吞噬性細(xì)胞。該申請(qǐng)也描述了用附加型復(fù)制質(zhì)粒DNA上攜帶的異源核酸將產(chǎn)生微細(xì)胞的親代細(xì)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化。親代細(xì)菌和微細(xì)胞分離時(shí)，某些分離的附加DNA分離進(jìn)入微細(xì)胞。產(chǎn)生的重組微細(xì)胞易于被哺乳動(dòng)物吞噬性細(xì)胞吞入，并在細(xì)胞內(nèi)的吞噬小體內(nèi)被降解。令人驚奇地是，有些重組DNA逃脫吞噬小體膜，并被運(yùn)送進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞核，在此重組基因被表達(dá)。因而，該申請(qǐng)表明了微細(xì)胞在人類或動(dòng)物基因治療中的可用性。4本發(fā)明建立在這些與微細(xì)胞相關(guān)的最新發(fā)現(xiàn)上，其解決了對(duì)改善藥物遞送策略、尤其是癌癥化療領(lǐng)域內(nèi)的持續(xù)需求。
發(fā)明內(nèi)容為了解決這些和其它的需要，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供基本上由包含藥物例如癌癥化療藥物的完整微細(xì)胞組成的組合物。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供包含以下組分的組合物(i)細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞，和(ii)其藥學(xué)接受的載體，其中所述微細(xì)胞包含藥物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供靶向藥物遞送的方法，其包括將雙特異性配體接觸⑴包含期望藥物的細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞和(ii)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該雙特異性配體對(duì)微細(xì)胞表面組分和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面組分都有特異性。因而，所述配體引起微細(xì)胞結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞，微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入，并且藥物釋放入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。本發(fā)明也提供用于將微細(xì)胞載體靶向哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的雙特異性配體。所述雙特異性配體可以是多肽、碳水化合物或糖肽，并可以包含抗體或抗體片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雙特異性配體具有第一臂和第二臂，第一臂載有對(duì)細(xì)菌微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的特異性，第二臂載有對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的特異性。用于結(jié)合配體的期望的微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)為脂多糖的0-多糖組分。用于結(jié)合配體的期望的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)為受體，優(yōu)選為那些能活化受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體。在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含(i)包含藥物分子的細(xì)菌來(lái)源微細(xì)胞和(ii)雙特異性配體，其能結(jié)合至微細(xì)胞的表面組分和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面組分。本發(fā)明提供另一種藥物遞送方法，其致使包含藥物的細(xì)菌來(lái)源微細(xì)胞接觸哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，所述哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞具有吞噬作用或胞吞作用的能力。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入載有藥物的微細(xì)胞，然后微細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)釋放它們的藥物負(fù)載。本發(fā)明還提供將藥物加載微細(xì)胞的方法。一種這樣的方法涉及在包含微細(xì)胞的細(xì)胞外介質(zhì)和微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)之間創(chuàng)建濃度梯度。藥物可沿該濃度梯度自然移動(dòng)，進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。將藥物加載微細(xì)胞的另一種方法涉及在一定條件下培養(yǎng)重組的親代細(xì)菌細(xì)胞，其中所述親代細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼藥物的治療性核酸，使得藥物釋放入親代細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)親代細(xì)菌細(xì)胞分裂并形成子代微細(xì)胞時(shí)，所述微細(xì)胞在它們的細(xì)胞質(zhì)中也包含藥物。將藥物加載微細(xì)胞的另一種方法涉及在一定條件下培養(yǎng)包含編碼藥物的治療性核酸的重組微細(xì)胞，使得治療性核酸在微細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。本發(fā)明也提供細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞和雙特異性配體在制備藥物中的用途，所述藥物用于通過(guò)將藥物施予細(xì)胞、組織或器官而治療疾病或改良性狀的方法。在所述藥物中，微細(xì)胞包含藥物分子和能結(jié)合微細(xì)胞和哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的雙特異性配體。這樣的藥物可用于治療多種病況和疾病，包括獲得性疾病如aids、肺炎和肺結(jié)核，但尤其可用于癌癥化療領(lǐng)域。本發(fā)明提供相對(duì)于常規(guī)藥物治療技術(shù)的顯著改善，其通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)(i)降低藥物相關(guān)的毒性，因?yàn)樗幬锉惶禺愋赃f送至靶細(xì)胞內(nèi)，(ii)在人或動(dòng)物的給藥部位減緩藥物相關(guān)的副作用，因?yàn)樗幬锉话b在微細(xì)胞內(nèi)而不能在藥部位與非靶向細(xì)胞和組織相互作用，(iii)消除連續(xù)輸注藥物的需要，因?yàn)橹委焺┝康陌邢蚝桶b藥物的微細(xì)胞可通過(guò)常規(guī)注射給藥，(iv)減少藥物的有效劑量，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了特異性靶向，和(ν)有時(shí)消除了純化藥物的需要，因?yàn)樗幬锟捎晌⒓?xì)胞藥物遞送載體或親代細(xì)菌生物合成。使用用于藥物生物合成和靶向遞送至期望哺乳動(dòng)物細(xì)胞的微細(xì)胞構(gòu)成了特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵S多藥物通常從稀有植物或海洋來(lái)源中提取，或非常難以化學(xué)合成。另外，一些化療藥物，包括甲氨蝶呤，經(jīng)由膜相關(guān)的主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。圖1是顯示高效液相色譜(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MQ定量包裝在微細(xì)胞(微細(xì)胞DQX)中的阿霉素的圖。用外部介質(zhì)中各種濃度的阿霉素包裝切108微細(xì)胞(顯示于X-軸)。純化微細(xì)胞·，并用新方法提取阿霉素(在實(shí)施例3中描述)。使用HPLC(圓圈)和LC-MS(三角形)測(cè)定阿霉素的濃度，并繪制在y-軸上。圖2是顯示經(jīng)由微細(xì)胞·體外遞送藥物至人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)的圖。對(duì)用EGFR靶向的微細(xì)胞處理的細(xì)胞嚴(yán)^微細(xì)胞胃)、非靶向的微細(xì)胞MX處理的細(xì)胞(ΦΙΕ@微細(xì)胞·)、游離阿霉素處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。處理后6天內(nèi)，用游離阿霉素或EeFK微細(xì)胞_處理的細(xì)胞表現(xiàn)出僅約30%的活力。未處理的細(xì)胞和用微細(xì)胞腿處理的細(xì)胞表現(xiàn)出正常細(xì)胞活力。圖3顯示EGFR-靶向的、包裝阿霉素的微細(xì)胞(EGFK微細(xì)胞D。x)對(duì)人乳癌異種移植物的高度顯著的治療作用。腫瘤體積顯示在y_軸，建立異種移植后天數(shù)顯示在χ-軸。χ-軸下的實(shí)心三角形指示施予各種處理的天數(shù)。χ-軸下的空心三角形指示對(duì)照組G5和G6處理的變化，其中施用—微細(xì)胞而不是微細(xì)胞Dra。圖例表明施予8組小鼠中每組的各種處理(n=11/組)。圖4顯示EGFR-靶向的、包裝紫杉醇(Paclitaxel)的微細(xì)胞(EGFK微細(xì)胞&。)對(duì)人乳癌異種移植物的高度顯著的治療作用。腫瘤體積顯示在y_軸，建立異種移植后天數(shù)顯示在χ-軸。χ-軸下的實(shí)心三角形指示施予各種處理的天數(shù)。圖例表明了施予8組小鼠中每組的各種處理(n=11/組)。圖5顯示HER2/neU_靶向的、包裝阿霉素的微細(xì)胞(HEK2微細(xì)胞麗)對(duì)人卵巢癌異種移植物的高度顯著的治療作用。所述微細(xì)胞來(lái)源于鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(S.t.)或大腸桿菌(E.coli)(E.c.)minCDE-親代菌株。腫瘤體積顯示在y_軸，建立異種移植后天數(shù)顯示在χ-軸。χ-軸下的實(shí)心三角形指示施予各種處理的天數(shù)。圖例表明了施予7組小鼠中每組的各種處理(n=11/組)。圖6顯示EGFR-靶向的、包裝阿霉素的微細(xì)胞(EeFK微細(xì)胞腿)對(duì)腫瘤穩(wěn)定/退化的劑量效應(yīng)作用。在Balb/cnu/nu小鼠中建立MDA-MB-468腫瘤異種移植物，用含兩種不同濃度阿霉素的IO6UO7或IO8—微細(xì)胞靜脈注射處理各組(n=11)。腫瘤體積顯示在y_軸，建立異種移植后天數(shù)顯示在χ-軸。χ-軸下的實(shí)心三角形指示施予各種處理的天數(shù)。圖例表明了施予7組小鼠中每組的各種處理。具體實(shí)施方式本發(fā)明人已經(jīng)確定，細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞是體外和體內(nèi)包裝和遞送藥物至哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的有效載體。更特別地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)載有藥物負(fù)荷的微細(xì)胞可被指向靶細(xì)胞，靶細(xì)胞將微細(xì)胞內(nèi)化并加工，使得藥物負(fù)荷釋放入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。令人驚奇地，該藥物在加工后繼續(xù)存在而沒(méi)有被降解。在這些發(fā)現(xiàn)的一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明人觀察到包裝藥物的微細(xì)胞可靶向癌癥細(xì)胞，被癌細(xì)胞體外內(nèi)化，并在次級(jí)內(nèi)體或吞噬小體內(nèi)被降解，從而釋放治療有效量的生物活性藥物進(jìn)入癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。參見(jiàn)如下的實(shí)施例。在另一個(gè)實(shí)例中，在裸鼠中用人腫瘤異種移植物的體內(nèi)研究證實(shí)了這些觀察結(jié)果。靜脈內(nèi)遞送包裝藥物的微細(xì)胞證實(shí)了在所有小鼠(每組11只小鼠)中高度顯著地縮減腫瘤異種移植物。參見(jiàn)如下的實(shí)施例。因而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(i)大量的不同藥物可被包裝入完整微細(xì)胞，(ii)藥物從細(xì)胞外環(huán)境單向移動(dòng)進(jìn)入完整微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，(iii)治療顯著濃度的藥物可被轉(zhuǎn)入完整微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，(iv)完整微細(xì)胞的細(xì)胞膜不能透過(guò)藥物，使藥物不能從微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中漏出，(ν)雙特異性配體與包裝藥物的微細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)的連接不能使微細(xì)胞不穩(wěn)定，因而，微細(xì)胞可特異性地體外和體內(nèi)結(jié)合哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，(vi)有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入包裝藥物的微細(xì)胞，(vii)非吞噬性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞快速吞入結(jié)合表面受體的包裝藥物微細(xì)胞，(viii)微細(xì)胞在被吞噬入，在液泡內(nèi)被降解，顯著量的生物活性藥物從液泡膜脫逸，(viii)釋出的藥物可作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)靶，(ix)包裝化療藥物的微細(xì)胞可體內(nèi)滲透穿過(guò)腫瘤實(shí)體周圍的易漏脈管，(χ)使用包裝化療藥物的微細(xì)胞可獲得非常顯著的治療效果，包括腫瘤退化和疾病穩(wěn)定化，和(xi)包裝藥物的微細(xì)胞顯著地降低或消除不期望的毒性。由于某些原因，微細(xì)胞包裝藥物的能力是令人驚奇的。令人驚奇地是，所述完整微細(xì)胞膜對(duì)大量結(jié)構(gòu)不相似的親水性、疏水性和兩性藥物是可滲透的。相反，活的細(xì)菌細(xì)胞對(duì)溶質(zhì)表現(xiàn)出選擇性膜滲透性，因而似乎微細(xì)胞已經(jīng)喪失了這種選擇性。也令人驚奇地是，微細(xì)胞不能從它們的細(xì)胞質(zhì)中排除藥物，因?yàn)榛畹募?xì)菌能排出進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的毒性化學(xué)物質(zhì)。即使相對(duì)于逆向滲透梯度，其中載有藥物的微細(xì)胞懸在不含藥物的磷酸鹽緩沖液中，微細(xì)胞仍保留藥物。這一點(diǎn)又是令人驚奇地，因?yàn)樗幬锼坪鹾?jiǎn)單地通過(guò)完整的微細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入微細(xì)胞，然而沒(méi)有使藥物擴(kuò)散出微細(xì)胞的擴(kuò)散通道可用。本發(fā)明的另一個(gè)意想不到的方面是治療顯著的藥物濃度可包裝在微細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞質(zhì)(因而，和微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì))包含顯著濃度的生物相容性溶質(zhì)。因此，相信可能沒(méi)有足夠的多余細(xì)胞內(nèi)空間來(lái)容納高濃度的非生物相容性藥物溶質(zhì)，而不喪失微細(xì)胞完整性。由于一些原因，微細(xì)胞遞送藥物的能力也是令人驚奇的。意想不到的是，例如包裝藥物的微細(xì)胞不將藥物漏入細(xì)胞外空間。這是用脂質(zhì)體藥物遞送載體的長(zhǎng)期以來(lái)的問(wèn)題，并且微細(xì)胞象脂質(zhì)體一樣不是有生命的載體。然而，盡管完整的微細(xì)胞膜對(duì)藥物滲透缺乏選擇性，膜的完整性足夠防止細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)漏出。而且令人驚奇地是，和脂質(zhì)體藥物遞送載體不同，配體與包裝藥物的微細(xì)胞表面的結(jié)合不引起導(dǎo)致藥物漏出的微細(xì)胞完整性不穩(wěn)定或膜擾動(dòng)。而且，意想不到的是，包裝藥物的微細(xì)胞可被非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞快速內(nèi)吞，僅僅通過(guò)連接二者的雙特異性配體。至今為止普遍相信，大顆粒如細(xì)菌僅能通過(guò)由活病原體分泌侵襲相關(guān)蛋白參與的主動(dòng)過(guò)程滲透和侵襲非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。微細(xì)胞是缺少主動(dòng)侵襲吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的無(wú)生命小泡。另外，還令人驚奇地是載有雙特異性配體的包裝藥物的微細(xì)胞能體內(nèi)滲出腫瘤新生血管。雖然對(duì)腫瘤微環(huán)境新血管系統(tǒng)的泄漏程度有很多爭(zhēng)論，但是當(dāng)前的觀點(diǎn)是新血管系統(tǒng)中的孔直徑為150-400nm(GabiZonetal.,2003)。然而，載有表面配體的微細(xì)胞的直徑為400nm-600nm，但是仍舊能在體內(nèi)滲出腫瘤新血管。由于一些原因，包裝在微細(xì)胞中的藥物避免降解的能力也是令人驚奇的。被吞入的微細(xì)胞面臨溶酶體和次級(jí)內(nèi)體環(huán)境，這種環(huán)境已知是惡劣的并將破壞微細(xì)胞。盡管這些環(huán)境很惡劣，本發(fā)明人觀察到大量藥物從微細(xì)胞中以生物活性形式釋放，并保持明顯的不變性?？赡芨钊梭@奇地是發(fā)現(xiàn)顯著濃度的藥物以其活性形式能逃逸進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。按照本發(fā)明，即，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度在體外和在體內(nèi)試驗(yàn)中都足夠產(chǎn)生治療效果。另外還令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是包裝藥物的微細(xì)胞將不利的副作用降至最小。例如，在裸鼠尾靜脈的靜脈注射部位，游離藥物注射會(huì)引起嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)，而包裝藥物的微細(xì)胞不引起這樣的不利副作用。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供基本上由含期望藥物的完整微細(xì)胞組成的組合物，所述藥物如癌癥化療藥物。本發(fā)明也提供包含(i)細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞和(ii)藥學(xué)接受載體的組合物，其中微細(xì)胞包含藥物，例如癌癥化療藥物。本發(fā)明的微細(xì)胞為大腸桿菌或其它細(xì)菌細(xì)胞的無(wú)核形式，其由與DNA分離一起的細(xì)胞分裂的二分分裂期間的協(xié)調(diào)紊亂造成。原核染色體復(fù)制與正常的二分分裂相聯(lián)，這涉及細(xì)胞中隔的形成。在大腸桿菌中，例如，min基因例如minCD突變可消除在細(xì)胞分裂期間細(xì)胞極處形成隔膜的抑制，導(dǎo)致生成正常子細(xì)胞和無(wú)核微細(xì)胞。參見(jiàn)deBoeretal.,1992；Raskin&deBoer,1999；Hu&Lutkenhaus，1999;Harry，2001。微細(xì)胞與其它的小泡不同，其它小泡在某些情形下被自發(fā)地產(chǎn)生和釋放，與微細(xì)胞相反，不是由于特異性遺傳重排或附加體基因表達(dá)。對(duì)于實(shí)施本發(fā)明而言，期望微細(xì)胞具有完整的細(xì)胞壁(”完整微細(xì)胞”)。除了min操縱子突變外，在影響隔膜形成的很多其它遺傳重排或突變后也產(chǎn)生無(wú)核微細(xì)胞，例如在枯草桿菌的divIVBl中。參見(jiàn)ReeveandCornet,1975；Levinetal.，1992。在參與細(xì)胞分裂/染色體分離的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)水平受到干擾后，也可形成微細(xì)胞。例如，minE的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致極性分裂(polardivision)和微細(xì)胞的生成。類似地，較少染色體的微細(xì)胞可由染色體分離的缺陷引起，例如枯草桿菌的smc突變(Brittonetal.,1998)、枯草桿菌中的spoOJ缺失(Iretonetal.，1994)、大腸桿菌中的mukB突變(Hiragaetal.，1989)和大腸桿菌中的parC突變GtewartandD'Ari,1992)基因產(chǎn)物可以反式(intrans)提供。當(dāng)從高拷貝數(shù)的質(zhì)粒過(guò)表達(dá)時(shí)，例如，CafA可增強(qiáng)細(xì)胞分裂的速率和/或抑制復(fù)制后的染色體分隔(Okadaetal.，1994)，導(dǎo)致形成鏈?zhǔn)郊?xì)胞和無(wú)核微細(xì)胞(Wachietal.,1989；Okadaetal.，1993)。微細(xì)胞可由任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性起源的細(xì)菌細(xì)胞制備。本發(fā)明的微細(xì)胞包含一種或多種藥物。術(shù)語(yǔ)”藥物”包含任意生理或藥理活性物質(zhì)，其能在動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物和人中產(chǎn)生局部或系統(tǒng)性作用。藥物可以是無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物，不受限制地，包括肽、蛋白質(zhì)、核酸和小分子，其中的任一種可以被表征或未表征。它8們可以是各種形式，例如無(wú)變化的分子、分子復(fù)合物、藥理學(xué)可接受的鹽例如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、月桂酸鹽、棕櫚酸鹽、磷酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、水楊酸鹽等。對(duì)于酸性藥物而言，可使用金屬鹽、銨鹽或有機(jī)陽(yáng)離子鹽，例如季銨鹽。也可使用藥物的衍生物，例如堿、酯和酰胺。水不溶性藥物可使用其水溶性衍生物形式或作為其堿性衍射物使用，其在任意情況下，或通過(guò)遞送，由酶轉(zhuǎn)化、由身體PH水解或由其它代謝過(guò)程轉(zhuǎn)化為其原始的治療活性形式。具有任意生理或藥理活性的藥物都可用于本發(fā)明，但是癌癥化療劑是優(yōu)選的藥物。有用的癌癥化療藥物包括氮芥、亞硝基脲(nitrosorueas)、乙烯亞胺、磺酸烷酯、四嗪、鉬化合物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、葉酸類似物、蒽環(huán)類、紫杉烷類、長(zhǎng)春花堿類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和激素劑。示例性化療藥物為放線菌素D、左旋苯丙氨酸氮芥(Alkeran)、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡魯胺、博來(lái)霉素、白消安、卡培他濱、卡鉬、Carboplatinum、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、CPT-11、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D(Dactinomycin)、柔紅霉素、右丙亞胺、多西他賽、阿霉素、DTIC、表阿霉素(Epirubicin)、乙撐亞胺、依托泊苷、氟尿嘧啶脫氧核苷(Floxuridine)、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、赫賽汀、六甲胺、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、依立替康、洛莫司汀、氮芥(Mechlorethamine)、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奧沙利鉬、紫杉醇、氨羥二磷酸二鈉(Pamidronate)、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴胼、美羅華(Rituximab)、類固醇、鏈佐星、STI-571、鏈佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鳥嘌呤、塞替派、雷替曲塞(Tomudex)、托泊替康、蘇消安(Treosulphan)、三甲曲沙、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、VP-16和希羅達(dá)。本發(fā)明的包含微細(xì)胞的組合物優(yōu)選包含每IO7微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞，更優(yōu)選包含每IO8微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞，甚至更優(yōu)選包含每IO9微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞，仍舊更優(yōu)選包含每IOltl微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞和最優(yōu)選包含每IO11微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。純化微細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，描述于PCT/IB02/04632。一種這樣的方法結(jié)合錯(cuò)流過(guò)濾(進(jìn)料流與膜表面平行；Forbes，1987)和死端式過(guò)濾(進(jìn)料流與膜表面垂直)。任選地，可以在過(guò)濾組合之前以低離心力進(jìn)行差速離心，來(lái)除去某些部分的細(xì)菌細(xì)胞，從而富集微細(xì)胞的上清液。另一種純化方法利用在生物相容性介質(zhì)中的密度梯度離心。離心后，從梯度中收集微細(xì)胞帶，和任選地，微細(xì)胞再接受多輪密度梯度離心以使純度達(dá)到最大。該方法還可包括對(duì)包含微細(xì)胞的樣品實(shí)施差速離心的初始步驟。當(dāng)在低離心力下實(shí)施時(shí)，差速離心將除去親代細(xì)菌細(xì)胞的一些部分，從而富集微細(xì)胞的上清液。特別有效的純化方法利用細(xì)菌成絲作用來(lái)增加微細(xì)胞純度。因而，微細(xì)胞純化方法可包括步驟(a)將包含微細(xì)胞的樣品置于誘導(dǎo)親代細(xì)菌細(xì)胞采用絲狀體形式的條件，隨后(b)過(guò)濾樣品以得到純化的微細(xì)胞制劑。也可以組合已知的微細(xì)胞純化方法。一種高度有效的組合方法如下步驟A差速離心產(chǎn)生微細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物。這一步驟可以在2000g進(jìn)行約20分鐘，除去大多數(shù)親代細(xì)菌細(xì)胞，同時(shí)將微細(xì)胞留在上清液中。步驟B使用等滲和無(wú)毒的密度梯度介質(zhì)進(jìn)行密度梯度離心。這一步驟使許多污染物與微細(xì)胞分離，伴有最少限度的微細(xì)胞損失，所述雜質(zhì)包括親代細(xì)菌細(xì)胞。優(yōu)選地，在純化方法內(nèi)重復(fù)該步驟。步驟C通過(guò)0.45μm過(guò)濾器錯(cuò)流過(guò)濾以進(jìn)一步減少親代細(xì)菌細(xì)胞污染。步驟D剩余親代細(xì)菌細(xì)胞的脅迫誘導(dǎo)的成絲作用。這可以通過(guò)使微細(xì)胞懸液經(jīng)受幾種誘導(dǎo)脅迫的環(huán)境條件的任一種中來(lái)完成。步驟E抗生素處理以殺死親代細(xì)菌細(xì)胞。步驟F錯(cuò)流過(guò)濾來(lái)除去小污染物，例如膜泡(membraneblebs)、膜碎片、細(xì)菌碎片、核酸、介質(zhì)組分等，并且濃縮微細(xì)胞?？蓱?yīng)用0.2μm過(guò)濾器來(lái)分離小污染物與微細(xì)胞，并可使用0.1μm過(guò)濾器來(lái)濃縮微細(xì)胞。步驟G死端式過(guò)濾來(lái)消除絲狀的死細(xì)菌細(xì)胞。這一步驟可使用0.45μm過(guò)濾器。步驟H從微細(xì)胞制劑中除去內(nèi)毒素。這一步驟可使用包被抗LipidA的磁珠。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供靶向藥物遞送方法，其包含使雙特異性配體接觸(i)包含藥物分子的細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞和(ii)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述雙特異性配體對(duì)微細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞組分都具有特異性，引起微細(xì)胞結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使微細(xì)胞被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入，藥物釋放入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這一方法廣泛適用于大量哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括通?？咕芴禺愋哉掣胶蛢?nèi)吞微細(xì)胞的細(xì)胞。例如，雙特異性抗體配體有效地使微細(xì)胞結(jié)合至廣泛圍的非吞噬性靶細(xì)胞上的各自受體上，所述配體在一臂上具有抗-ο-多糖的特異性，和在另一臂具有抗-HER2受體、抗-EGF受體或抗-雄激素受體的特異性。這些細(xì)胞包括肺、卵巢、腦、乳腺、前列腺和皮膚癌細(xì)胞。而且，有效的結(jié)合在每個(gè)非吞噬性細(xì)胞快速內(nèi)吞微細(xì)胞之前。本發(fā)明的靶向細(xì)胞包括待導(dǎo)入藥物的任何細(xì)胞。當(dāng)涉及藥物時(shí)使用“導(dǎo)入”指微細(xì)胞內(nèi)攜帶的藥物被遞送至靶細(xì)胞，優(yōu)選靶細(xì)胞內(nèi)。期望靶細(xì)胞的特征在于其表達(dá)細(xì)胞表面受體，當(dāng)該受體結(jié)合配體時(shí)，將輔助內(nèi)吞作用。優(yōu)選的靶細(xì)胞是非吞噬性細(xì)胞，意思是指不是專門的吞噬細(xì)胞的細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞。優(yōu)選的靶細(xì)胞也為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的靶向藥物遞送方法中使用的配體包括結(jié)合靶細(xì)胞上表面組分和微細(xì)上表面組分的任何試劑。優(yōu)選地，靶細(xì)胞上的表面組分為受體，尤其是能介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體。所述配體可以包括多肽和/或糖組分?？贵w是優(yōu)選的配體。例如，雙特異性抗體可有效地用于將微細(xì)胞在體外和體內(nèi)靶向哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，所述雙特異性抗體對(duì)細(xì)菌來(lái)源完整微細(xì)胞的表面組分和哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的表面組分具有雙重特異性。有用的配體也包括受體、酶、結(jié)合肽、融合蛋白/嵌合蛋白和小分子。特定配體的選擇是依照兩個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)(i)特異性結(jié)合完整微細(xì)胞表面上的一個(gè)或多個(gè)域，和(ii)特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面上的一個(gè)或多個(gè)域。因而，配體優(yōu)選具有第一臂和第二臂，第一臂載有對(duì)細(xì)菌來(lái)源完整微細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)的特異性，第二臂載有對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的特異性。第一臂和第二臂的每一個(gè)可以是多價(jià)的。優(yōu)選地，即使是多價(jià)的，每個(gè)臂也是單特異性的。為了結(jié)合細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞，期望配體的一個(gè)臂對(duì)親代細(xì)菌細(xì)胞上的脂多糖的10ο-多糖組分具有特異性。其它的可用于配體結(jié)合的微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)包括暴露于細(xì)胞表面的多肽和外膜上的糖，例如菌毛(Pilli)、纖毛(fimbrae)和鞭毛細(xì)胞表面暴露的肽區(qū)段。為了結(jié)合靶細(xì)胞，配體的一個(gè)臂對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面組分具有特異性。這樣的組分包括細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、肽和糖類，可以是特征性的或非特征性的。細(xì)胞表面受體，尤其是能活化受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用的那些是期望的用于靶向的細(xì)胞表面組分。這樣的受體，如果在靶細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)，對(duì)靶向待處理的細(xì)胞給予另外的選擇性，因而減少了遞送給非靶向細(xì)胞的可能性。作為實(shí)例，可以通過(guò)選擇特異性結(jié)合期望細(xì)胞上細(xì)胞表面受體基序的配體，來(lái)靶向腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、脈管系統(tǒng)細(xì)胞例如內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、血液細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腦細(xì)胞、肝細(xì)胞等，或任意的選定細(xì)胞的前體。細(xì)胞表面受體的實(shí)例包括癌胚抗原(CEA)，其在大多數(shù)結(jié)腸、直腸、乳腺、肺、胰腺和胃腸道癌中過(guò)表達(dá)(Marshall，2003)；heregulin受體(HER-2、neu或c-erbB-2)，其經(jīng)常在乳腺、卵巢、結(jié)腸、肺、前列腺和宮頸癌中過(guò)表達(dá)(Hungetal.,2000)；表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，其在多種實(shí)體瘤中高度過(guò)表達(dá)，包括乳腺、頭和頸、非小細(xì)胞肺和前列腺的實(shí)體瘤(Salomonetal.,1995)；唾液酸糖蛋白受體(Stockert，1995)；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Singh，1999)；絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)酶復(fù)合物受體，其在肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(Ziadyetal.,1997)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)，其在胰管腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(Kleeffetal.,2002)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)，用于抗血管生成的基因治療(Beckeretal.，2002andHoshidaetal.，2002)；葉酸受體，其在90%的非粘液性(nonmucinous)卵巢癌中選擇性過(guò)表達(dá)(GosselinandLee,2002)；細(xì)胞表面糖萼(Batraetal.，1994)；糖受體(Thurnheretal.，1994)；和聚合型免疫球蛋白受體，其用于將基因遞送至呼吸道上皮細(xì)胞，并對(duì)治療肺疾病例如囊性纖維病有吸引力(Kaetzeletal.，1997)。在另一個(gè)實(shí)例中，抗病毒、抗微生物和抗寄生蟲藥物可被摻入完整微細(xì)胞，并可以實(shí)現(xiàn)靶向遞送藥物至特異性感染細(xì)胞，例如HIV感染的輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞。優(yōu)選的配體包括抗體和/或抗體衍生物。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”包含通過(guò)體外或體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性應(yīng)答得到的免疫球蛋白分子。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括多克隆、單特異性和單克隆抗體，以及抗體衍生物，例如單鏈抗體片段(scFv)。在本發(fā)明中有用的抗體和抗體衍生物也可以通過(guò)重組DNA技術(shù)得到。野生型抗體具有四個(gè)多肽鏈，兩個(gè)相同的重鏈和兩個(gè)相同的輕鏈。兩種類型的多肽鏈都具有恒定區(qū)和可變區(qū)，恒定區(qū)在同一類型的抗體內(nèi)不改變或改變極小?？勺儏^(qū)對(duì)特定抗體是唯一的，其包含識(shí)別特異性表位的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。最直接參與抗體結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)域?yàn)椤盎パa(bǔ)性決定區(qū)”(CDRs)。術(shù)語(yǔ)”抗體”也包括抗體的衍生物，例如保留特異性結(jié)合抗原能力的抗體片段。這樣的抗體片段包括Fab片段(含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段，其包含通過(guò)二硫鍵連接的輕鏈和部分重鏈)、Fab’(含有單個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段，包含F(xiàn)ab和跨絞鏈區(qū)的重鏈的另外部分)、F(ab’)2(通過(guò)重鏈絞鏈區(qū)中的鏈間二硫鍵連接的兩個(gè)Fab’分子)、雙特異性Fab(具有兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Fab分子，其中的每個(gè)可指向不同表位)和scFv(通過(guò)氨基酸鏈連接在一起的抗體的單個(gè)輕鏈和重鏈的可變的、抗原結(jié)合決定性區(qū)域)。當(dāng)抗體，包括抗體片段，構(gòu)成配體的部分或全部時(shí)，優(yōu)選它們?yōu)槿藖?lái)源的或經(jīng)修飾11適用于人類。所謂的”人源化抗體”是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Osbournetal.，2003。它們經(jīng)過(guò)遺傳操作和/或體外處理被修飾以降低它們?cè)谌酥械目乖浴Ｈ嗽椿贵w的方法描述于例如，美國(guó)專利No.6，639，055,No.5，585，089和No.5，530，101。在最簡(jiǎn)單的情況下，人源化抗體是通過(guò)將來(lái)自小鼠mAb的抗原結(jié)合環(huán)移植入人IgG中形成的，所述抗原結(jié)合環(huán)也稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)。參見(jiàn)Jonesetal.，1986；Riechmannetal.，1988；andVerhoeyenetal.，1988。然而，高親和力的人源化抗體的產(chǎn)生通常需要轉(zhuǎn)移一個(gè)或多個(gè)來(lái)自小鼠親代mAb的所謂框架區(qū)(FRs)的另外的殘基。也已經(jīng)開發(fā)了人源化技術(shù)的某些變化方案。參見(jiàn)Vaughanetal.，1998。除了”人源化抗體”，人抗體也可以用于本發(fā)明。它們對(duì)各自的抗原具有高親和力，通常從非常大的、單鏈可變性片段(scFvs)或Fab噬菌體展示文庫(kù)獲得。參見(jiàn)Griffithsetal.，1994；Vaughanetal.，1996；Sheetsetal.，1998；deHaardetal.，1999；andKnappiketal.，2000。有用的配體也包括雙特異性單鏈抗體，其典型地為重組多肽，該多肽由可變輕鏈部分通過(guò)連接分子共價(jià)結(jié)合相應(yīng)的可變重鏈部分組成。參見(jiàn)美國(guó)專利5，455，030;5J60，203和4，496，778。雙特異性抗體也可以由其它方法制備。例如，化學(xué)異綴合物(heteroconjugates)可通過(guò)化學(xué)連接不同特異性的完整抗體或抗體片段制備。參見(jiàn)Karpovskyetal.，1984。然而，這樣的異綴合物難于以可重現(xiàn)性方式制備，并且至少是正常單克隆抗體的兩倍大。雙特異性抗體也可由二硫鍵交換制備，其涉及酶切和抗體片段的重新組合。參見(jiàn)Glennieetal.，1987。因?yàn)镕ab和scFv片段是單價(jià)的，它們通常對(duì)靶結(jié)構(gòu)具有低親和力。因此，由這些組分制備的優(yōu)選配體被工程化為二聚、三聚或四聚偶聯(lián)體以增加功能性親和力。參見(jiàn)TomlinsonandHolliger,2000；Carter,2001；HudsonandSouriau,2001；andTodorovskaetal.，2001。這樣的偶聯(lián)體結(jié)構(gòu)可以由化學(xué)和/或遺傳交聯(lián)來(lái)制備。本發(fā)明的雙特異性配體優(yōu)選在每個(gè)末端為單特異性的，即在一個(gè)末端對(duì)微細(xì)胞上的單一組分有特異性，而在另一末端對(duì)靶細(xì)胞上的單一組分有特異性。所述配體可以在一個(gè)或兩個(gè)末端是多價(jià)的，例如以所謂的雙價(jià)抗體(diabodies)、三價(jià)抗體(triabodies)和四價(jià)抗體(tetrabodies)的形式。參見(jiàn)HudsonandSouriau，2003。雙價(jià)抗體為由兩個(gè)scFv的非共價(jià)結(jié)合形成的雙價(jià)二聚體，其產(chǎn)生了兩個(gè)Fv結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，三價(jià)抗體為由HfscFv的三價(jià)三聚體形成而產(chǎn)生的，得到了三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，四價(jià)抗體是由四個(gè)scFv的四價(jià)四聚體形成產(chǎn)生的，得到了四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。幾種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的受體具有特異性的人源化、人和小鼠的單克隆抗體及其片段已被批準(zhǔn)用于人類治療用途，并且該列表增長(zhǎng)迅速。參見(jiàn)HudsonandSouriau，2003。這樣的可用于形成雙特異性配體一個(gè)臂的抗體的實(shí)例為對(duì)HER2有特異性的=Herc印tin；Trastuzumabo抗體可變區(qū)也可融合至廣范圍的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。融合至人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域如IgGlCH3既增加質(zhì)量，又促進(jìn)二聚化。參見(jiàn)Huetal.，1996。融合至人Ig鉸鏈-Fc區(qū)域可增加效應(yīng)物功能。而且，融合至來(lái)自多聚體蛋白質(zhì)的異種蛋白結(jié)構(gòu)域促進(jìn)多聚化。例如短scFv與短雙親性螺旋的融合已用于制備微型抗體。參見(jiàn)I^ackandPluckthun，1992。來(lái)自可形成異二聚體的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，例如fos/jim，可被用于制備雙特異性分子(Kostelnyetal.，1992)，作為替代，通過(guò)工程策略例如“突起入孔”(knobsintoholes)，同二聚化結(jié)構(gòu)域可被改造形成異二聚體(Ridgwayetal.，1996)。最后，可選擇融合蛋白伴侶來(lái)提供多聚化以及另外的功能，例如鏈親合素。參見(jiàn)Dubeletal.，1995。在另一方面，本發(fā)明提供物質(zhì)的組合物，可用于高效的將藥物分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞。所述組合物包含(i)細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞和(ii)雙特異性配體。所述微細(xì)胞和配體可以是任意本文描述的任一種。因而，所述微細(xì)胞包含藥物，雙特異性配體優(yōu)選能結(jié)合微細(xì)胞的表面組分并能結(jié)合哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的表面組分。基本上由本發(fā)明的微細(xì)胞和雙特異性配體組成的組合物(即，包括這樣的微細(xì)胞和配體及其它成分的組合物，所述其它成分不會(huì)不利地干擾組合物的藥物遞送質(zhì)量)可以使用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑按常規(guī)方式配制。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)接受的”指載體或賦形劑不消除所施用組合物的生物活性，其為化學(xué)惰性的，且對(duì)被給藥的生物體無(wú)毒。制劑可以以單位劑量形式提供，例如裝入安瓿中或小瓶中，或裝入多劑量容器中，含有或不含有添加的防腐劑。所述制劑可以是在油性或水性載體中的溶液、懸液或乳液，并可以含有制劑助劑，例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。適當(dāng)?shù)娜芤菏桥c接受者的血液等滲的，例如鹽水、林格(氏)溶液和葡萄糖溶液。作為替代，組合物可以是凍干粉末形式，用于用適宜的載體重構(gòu)，所述載體例如無(wú)菌、無(wú)熱原的水或生理鹽水。該組合物也可以配制為儲(chǔ)庫(kù)制劑(cbpotpr印aration)。這樣的長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入(例如皮下或肌肉內(nèi)植入)或通過(guò)肌肉注射給藥。本發(fā)明的組合物可經(jīng)由多種途徑施用至哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多個(gè)部位，以得到期望的局部或系統(tǒng)性治療效果。遞送可以通過(guò)多種途徑完成，例如口服給藥、將制劑施用至體腔、通過(guò)吸入或吹入(insufflation)、或通過(guò)胃腸道外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)或皮內(nèi)給藥來(lái)完成。給藥模式和給藥部位取決于靶細(xì)胞的位置。例如囊性纖維化的細(xì)胞可以通過(guò)吸入遞送靶向重組微細(xì)胞來(lái)有效地靶向。類似地，轉(zhuǎn)移腫瘤可以經(jīng)由靜脈內(nèi)遞送靶向重組微細(xì)胞來(lái)更有效地治療。原發(fā)性卵巢癌可以經(jīng)由腹膜內(nèi)遞送靶向重組微細(xì)胞來(lái)治療。本發(fā)明還通過(guò)使細(xì)菌來(lái)源的含藥微細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸的方式來(lái)遞送藥物，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有吞噬或胞吞能力，這樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞能以細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體的方式吞入親代細(xì)菌細(xì)胞，也同樣能吞入微細(xì)胞，微細(xì)胞將負(fù)載的藥物釋放入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在不使用靶向配體下，這種藥物遞送方法可以實(shí)現(xiàn)。多種機(jī)制可能參與給定類型的細(xì)胞吞入微細(xì)胞，在這點(diǎn)上本發(fā)明不依賴任何具體的機(jī)制。例如，吞噬作用已經(jīng)研究很多的過(guò)程，其中巨噬細(xì)胞和其它吞噬細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞，通過(guò)伸展偽足至顆粒表面直到顆粒被完全包裹而攝入顆粒。盡管描述為”非特異性”吞噬作用，但已經(jīng)證實(shí)在該步驟中有特異性受體參與。參見(jiàn)Wright&J0ng(1986)；Speertetal.(1988)。因而，一種形式的吞噬作用涉及表面配體和位于偽足膜上的配體-受體之間的相互作用GhawandGriffin，1981)。這一由特異性受體介導(dǎo)的結(jié)合步驟被認(rèn)為依賴于細(xì)菌表面粘附素(adhesin)。至于毒力較弱的細(xì)菌，例如不產(chǎn)腸毒的大腸桿菌，在不存在噬菌細(xì)胞受體的表面配體的情況下，吞噬作用也可以發(fā)生。例如，參見(jiàn)Pikaaretal.(1995)。因而，本發(fā)明包括，但不限于，微細(xì)胞的用途，其中微細(xì)胞具有或缺乏表面粘附素，其保持親代細(xì)菌細(xì)胞的性質(zhì)，并且微細(xì)胞可被吞噬細(xì)胞(即有”吞噬能力”的宿主細(xì)胞)吞入，其中嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是哺乳動(dòng)物中主要的吞噬細(xì)胞類型。另一種吞入方法為內(nèi)吞作用，通過(guò)該作用，細(xì)胞內(nèi)的病原體進(jìn)入哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞，并在此復(fù)制，所述病原體的實(shí)例為沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、螺桿菌屬、假單胞菌屬和乳桿菌屬的物種。在這一點(diǎn)上兩種基本機(jī)理為依賴籠形蛋白的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，也稱為”被膜小窩的內(nèi)吞作用”(RieZman，1993)，和不依賴籠形蛋白的內(nèi)吞作用(Sandvig&Deurs，1994)。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)發(fā)揮內(nèi)吞作用的具有吞入能力的細(xì)胞(即有“內(nèi)吞作用能力”的宿主細(xì)胞)吞入微細(xì)胞時(shí)，上述一種或兩種都可能參與。代表性的有細(xì)胞內(nèi)吞作用的細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞、胃腸道中的腸細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和泌尿道及膀胱上皮細(xì)胞。當(dāng)不使用打靶配體遞送藥物至有吞入能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，本申請(qǐng)所包括的性質(zhì)將影響微細(xì)胞的細(xì)菌來(lái)源的選擇。例如，沙門氏菌屬、埃希氏桿菌屬和志賀氏菌屬攜帶粘附素，其可被胃腸道中腸細(xì)胞上介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體識(shí)別，并可以適于遞送對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有效的藥物。類似地，來(lái)源于幽門螺旋桿菌的微細(xì)胞，攜帶對(duì)胃上皮細(xì)胞特異性的粘附素，其可適于遞送藥物靶向至胃癌細(xì)胞。吸入或吹入可適于施用來(lái)源于假單胞菌屬的完整微細(xì)胞，該微細(xì)胞載有可被肺上皮細(xì)胞受體識(shí)別的粘附素。來(lái)源于乳桿菌屬細(xì)菌的微細(xì)胞，其載有對(duì)泌尿道和膀胱上皮細(xì)胞特異性的粘附素，可適于尿道內(nèi)遞送藥物至泌尿道或膀胱癌。本發(fā)明還提供細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞和雙特異性配體在制備用于治療疾病或改善性狀的方法的藥物中的用途，所述方法通過(guò)施用所述藥物至細(xì)胞、組織或器官來(lái)實(shí)現(xiàn)。在該藥物中，微細(xì)胞包含藥物分子，雙特異性配體能結(jié)合至微細(xì)胞和哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞。這樣的藥物可用于治療多種病癥和疾病，包括獲得性疾病例如AIDS、肺炎和肺結(jié)核，但是特別可用于癌癥化療方面。本發(fā)明還提供用藥物負(fù)載微細(xì)胞的方法。使用這些方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)親水性和疏水性藥物的包裝。用藥物負(fù)載微細(xì)胞的一種方法包括在包含微細(xì)胞的細(xì)胞外介質(zhì)和微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之間創(chuàng)建藥物的濃度梯度。當(dāng)細(xì)胞外介質(zhì)包含比微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)更高的藥物濃度時(shí)，藥物自然地沿該濃度梯度下移，進(jìn)入微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。然而，當(dāng)濃度梯度逆轉(zhuǎn)時(shí)，藥物不能移出微細(xì)胞。這樣，治療顯著量的藥物可被包裝在無(wú)生命的微細(xì)胞中而不會(huì)因?yàn)橐恍┰驖B漏，這是令人驚奇的。已知活的革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的外包膜，可對(duì)周圍介質(zhì)中的溶質(zhì)形成有效屏障，然而是水可透過(guò)的。這樣保護(hù)細(xì)菌不受有毒分子的有害作用，所述有毒分子例如生物殺滅劑和抗生素。也已知細(xì)菌包膜賦予對(duì)被動(dòng)擴(kuò)散和疏水性化學(xué)物的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入的內(nèi)在抗性，其不能穿過(guò)充滿水的親水性通道，該通道由稱為通道蛋白(porins)的膜相關(guān)蛋白形成。微細(xì)胞包含與它們的親代細(xì)菌細(xì)胞相同的外包膜。因此，令人^C奇地是，通過(guò)在微細(xì)胞外和微細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境之間創(chuàng)建簡(jiǎn)單的濃度梯度，親水性藥物例如阿霉素和長(zhǎng)春堿，和疏水性藥物例如紫杉醇，可以容易地轉(zhuǎn)移入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這提示無(wú)生命的細(xì)菌及其衍生物的包膜滲透性與活細(xì)菌的包膜滲透性非常不同。在微細(xì)胞內(nèi)藥物移動(dòng)僅僅在一個(gè)方向發(fā)生的發(fā)現(xiàn)是更令人驚奇的。已經(jīng)明確活細(xì)菌具有主動(dòng)排出過(guò)程，以除去偶爾進(jìn)入其細(xì)胞質(zhì)的有毒化學(xué)實(shí)體(綜述見(jiàn)14Borges-WalmsleyandWalmsley，2001)。這些過(guò)程由多藥運(yùn)輸?shù)鞍?transporter)介導(dǎo)，其是一大類和多樣性的蛋白質(zhì)，通過(guò)主動(dòng)外排出有毒化合物而能保護(hù)細(xì)胞免于廣泛的環(huán)境毒素?；谛蛄邢嗨菩裕嬖谥辽傥宸N已知的多藥運(yùn)輸?shù)鞍准易?。它們包?i)主要輔助蛋白(majorfacilitator)(MFS)，(ii)抗性成節(jié)細(xì)胞分裂(resistance-nodulation-celldivision)(RND),(iii)小的多藥抗性，(iv)多藥和毒性化合物排出，和(v)ATP結(jié)合盒家族。這些多藥運(yùn)輸?shù)鞍诪榧?xì)菌膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，廣泛分布于細(xì)菌物種中。多藥運(yùn)輸?shù)鞍讘?yīng)當(dāng)保存在微細(xì)胞膜中，然而它們令人驚奇地似乎是無(wú)功能的，可能因?yàn)槲⒓?xì)胞是無(wú)生命的，并且缺少驅(qū)動(dòng)多藥運(yùn)輸?shù)鞍妆匦璧摩ˇ肠?。?duì)于用通常非水溶性藥物負(fù)載微細(xì)胞而言，可將藥物首先溶于適宜的溶劑中。例如紫杉醇可溶于11的乙醇和cremophoreEL(聚氧乙烯蓖麻油)的混合物中，然后用PBS稀釋得到紫杉醇溶液，其部分稀釋于水介質(zhì)中，并含有最小量的有機(jī)溶劑以保證藥物保留在溶液中。微細(xì)胞可以培養(yǎng)在用于負(fù)載藥物的這種最終介質(zhì)中。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)即使疏水性藥物也可擴(kuò)散入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而獲得較高的和治療顯著量的細(xì)胞質(zhì)藥物負(fù)載。這是意想不到的，因?yàn)槲⒓?xì)胞膜由疏水性磷脂雙層組成，預(yù)期該雙層能防止疏水性分子擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。用藥物負(fù)載微細(xì)胞的另一種方法包括在一定條件下培養(yǎng)重組的親代細(xì)菌細(xì)胞，其中親代細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼藥物的治療性核酸，從而藥物釋放進(jìn)入親代細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。例如可以克隆編碼用于期望藥物的細(xì)胞生物合成途徑的基因簇并轉(zhuǎn)移到親代菌株中，該菌株能產(chǎn)生微細(xì)胞?；虼氐倪z傳轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致藥物在親代細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生物合成，從而細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中充滿藥物。當(dāng)親代細(xì)菌細(xì)胞分裂并形成子代微細(xì)胞時(shí)，微細(xì)胞在它們的細(xì)胞質(zhì)中也包含藥物。預(yù)包裝的微細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的以及上述的任意微細(xì)胞純化技術(shù)純化。類似地，用藥物負(fù)載微細(xì)胞的另一種方法包括在一定條件下培養(yǎng)重組微細(xì)胞，該微細(xì)胞包含編碼藥物的表達(dá)質(zhì)粒，使得編碼藥物的基因在微細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。對(duì)于在親代細(xì)菌細(xì)胞或微細(xì)胞內(nèi)直接生成藥物而言，親代細(xì)菌細(xì)胞或微細(xì)胞包含核酸分子，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，在細(xì)胞、組織或器官中起改善或治療疾病或改善性狀的作用。為了此處描述的目的，這樣的核酸分子歸類為”治療性核酸分子”。通常，治療性核酸發(fā)現(xiàn)于親代細(xì)菌或微細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。所述治療性核酸分子編碼藥物產(chǎn)品，例如功能性RNA(例如反義RNA或siRNA)或肽、多肽或蛋白質(zhì)，所述藥物產(chǎn)品的生成是期望的。例如感興趣的遺傳物質(zhì)可編碼有治療價(jià)值的激素、受體、酶或(多)肽。治療性核酸分子可以是這些基因的正常對(duì)應(yīng)物，所述基因表達(dá)功能異常的蛋白質(zhì)或在疾病狀態(tài)中以異常水平存在的蛋白質(zhì)，作為實(shí)例，例如囊性纖維癥中的囊性纖維病跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(conductanceregulator)(Keremetal.，1989；Riordanetal.,1989；Rommensetal.，1989)、鐮刀型細(xì)胞貧血癥中的β-珠蛋白、和地中海貧血癥中的α-珠蛋白、β-珠蛋白和Y-珠蛋白的任一種。如上所述，治療性核酸分子可具有反義RNA轉(zhuǎn)錄本或小干擾RNA。在癌癥的治療中，根據(jù)本發(fā)明適用的治療性核酸分子可以具有對(duì)應(yīng)或來(lái)源于與腫瘤抑制相關(guān)的基因的序列，所述基因例如Ρ53基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因和編碼腫瘤壞死因子的基因。大量實(shí)體瘤一癌癥、乳頭狀瘤和疣一將可以用根據(jù)本發(fā)明的這種方法治療。15在這一點(diǎn)上，代表性癌癥包括結(jié)腸癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胰癌、腦癌、頭頸癌和淋巴瘤。示例性乳頭狀瘤為鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤和喉乳頭狀瘤。疣病癥的實(shí)例為生殖器疣、腳底疣、疣狀表皮發(fā)育不良和惡性疣。本發(fā)明的治療性核酸分子也可包含編碼酶的DNA片段，所述酶可將無(wú)活性前藥轉(zhuǎn)化成一種或多種細(xì)胞毒性代謝物，使得當(dāng)體內(nèi)引入前藥時(shí)，效應(yīng)靶細(xì)胞以及可能與相鄰細(xì)胞一起被迫自殺?？梢允欠侨藖?lái)源的或人來(lái)源的這些“自殺基因”的臨床前和臨床應(yīng)用可參見(jiàn)綜述SpencerQ000)、Shangaraetal.(2000)和Yazawaetal.(2002)。非人來(lái)源的自殺基因的實(shí)例是分別編碼以下產(chǎn)物的基因HSV-胸苷激酶(tk)、胞嘧啶脫氨酶(CDA)+尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(GPT)、硝基還原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(phophrylase)(PNP,DeoD)、細(xì)胞色素P450(CYP4B1)、羧肽酶G2(CPG2)和D-氨基酸氧化酶(DAAO)ο人來(lái)源的自殺基因的實(shí)例分別是編碼以下產(chǎn)物的基因羧肽酶Al(CPA)、脫氧胞苷激酶(dCK)、細(xì)胞色素P450(CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas,FKBP/Caspases禾口ER/p53。根據(jù)本發(fā)明，治療性核酸典型地包含在親代細(xì)菌細(xì)胞或微細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。所述質(zhì)粒也可包含另外的作為調(diào)節(jié)元件起作用的核酸區(qū)段，例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子或信號(hào)序列，并且其可操作地連接至治療性核酸區(qū)段。本發(fā)明的親代細(xì)菌細(xì)胞或微細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒也可包含報(bào)告基因元件。報(bào)告基因元件賦予其重組宿主易于檢測(cè)的表型或特征，典型地由編碼多肽產(chǎn)生而不是由宿主產(chǎn)生，當(dāng)表達(dá)時(shí)，其可通過(guò)組織學(xué)或原位分析例如體內(nèi)成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)。例如，根據(jù)本發(fā)明，由完整微細(xì)胞遞送的報(bào)告基因元件可編碼一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在吞入宿主細(xì)胞中產(chǎn)生顏色或熒光變化，這些變化可通過(guò)原位分析檢測(cè)，并且是轉(zhuǎn)錄活化的定量或半定量函數(shù)。這些蛋白質(zhì)的實(shí)例為酯酶、磷酸酶、蛋白酶和其它酶類，其活性產(chǎn)生可檢測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。優(yōu)選的實(shí)例為大腸桿菌β-半乳糖苷酶和熒光素酶，β-半乳糖苷酶經(jīng)由切割顯藍(lán)色底物、吲哚基-β-D-半乳糖苷來(lái)引起顏色改變，熒光素酶氧化長(zhǎng)鏈醛(細(xì)菌熒光素酶)或雜環(huán)羧酸(熒光素)，并伴隨發(fā)光。在本文中也可使用的為編碼水母類生物Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(GFP)的報(bào)告基因元件，見(jiàn)I^rasheretal.(19%)。GFP-相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
可通過(guò)兩個(gè)公開的PCT申請(qǐng)來(lái)舉例說(shuō)明，WO095/21191(公開了編碼238個(gè)氨基酸的GFP脫輔基蛋白的多核苷酸序列，包含由氨基酸65-67形成的生色團(tuán))和WO095/21191(公開了對(duì)A.victoriaGFP的cDNA的修飾，提供了具有改變的熒光特性的肽)，還可參見(jiàn)Heimetal.(1994)的GFP突變體的報(bào)道，特征在于在激發(fā)強(qiáng)度上有4_6倍的提高。提供下述的實(shí)施例說(shuō)明是為了更充分地理解本發(fā)明，僅僅作為舉例說(shuō)明。實(shí)施例1.親水性癌癥化療藥物阿霉素和長(zhǎng)春堿在細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞中的有效包裝該實(shí)施例證明親水性藥物可被包裝在細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。阿霉素為從波賽鏈霉菌(Sti^ptomycespeucetius)中分離的強(qiáng)效抗有絲分裂的蒽環(huán)類抗生素，通常用于治療乳癌(Hendersonetal.，1989；Cowanetal.，1991；Chanetal.,1999；Paridaensetal.,2000；Norrisetal.，2000)。即使已經(jīng)有了紫杉燒類和其它新的藥劑可以使用，阿霉素保持對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移性疾病患者治療的主要用藥。在癌癥化療中，長(zhǎng)春花堿類組成了癌癥化療中受主要關(guān)注的化學(xué)種類。先導(dǎo)化合物，長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿已經(jīng)用于臨床實(shí)踐超過(guò)三十年，至今仍廣泛應(yīng)用。長(zhǎng)春堿通過(guò)在微管末端加帽而抑制細(xì)胞增殖，從而抑制有絲分裂的紡錘體微管運(yùn)動(dòng)。微細(xì)胞得自以前生成的鼠傷寒沙門氏菌min⑶E-突變株，如在國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/IB02/04632中所述，經(jīng)上述梯度離心/成絲/過(guò)濾/去除內(nèi)毒素過(guò)程純化。通過(guò)在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)區(qū)隔之間創(chuàng)建藥物的濃度梯度來(lái)將藥物包裝入微細(xì)胞。藥物沿該濃度梯度下移，穿過(guò)完整微細(xì)胞膜，進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。用化療藥物阿霉素(SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO,USA)如下包裝純化的微細(xì)胞。離心7xl09微細(xì)胞的BSG溶液，棄去上清液，將微細(xì)胞重新懸浮在940μ1BSG和60μ1的阿霉素溶液(lmg/ml，溶于無(wú)菌蒸餾水中)中。在37°C過(guò)夜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸浮液，以允許阿霉素?cái)U(kuò)散進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。然后通過(guò)如下的攪拌細(xì)胞超濾，洗除非特異性粘附到微細(xì)胞外表面的過(guò)量阿霉素。根據(jù)制造商的說(shuō)明使用超濾膜盤片(聚醚砜；截留分子量為300kDa；Millipore)來(lái)組裝Amicon攪拌式超濾器8010型(Millipore，Billerica,MA,USA)。用無(wú)菌蒸餾水洗滌細(xì)胞三次，接著再用BSG洗滌三次。然后用9ml新鮮BSG充滿細(xì)胞，加入Iml已包裝阿霉素的微細(xì)胞的溶液。保持細(xì)胞在IOpsi壓力下，攪拌直到體積減少至5ml，補(bǔ)充(topped-off)5mlBSG0繼續(xù)超濾直到體積再次減少至5ml。該補(bǔ)充(topping-off)/超濾操作進(jìn)行6次，以徹底洗滌包裝阿霉素的微細(xì)胞的外表面。在最后一次超濾期間，體積減少至Iml，將樣品轉(zhuǎn)移至無(wú)菌Eppendorf離心管中，然后在13，200rpm離心10分鐘，沉淀包裝阿霉素的微細(xì)胞。將包裝阿霉素的微細(xì)胞放置在載玻片上，因?yàn)榘⒚顾毓逃袩晒庑?，使用熒光顯微鏡觀察(LeicamodelDMLB光學(xué)顯微鏡、IOOx放大率；LeicaMicrosystems，Germany)。使用LeicaDC相機(jī)和LeicaIM圖像管理軟件來(lái)捕獲結(jié)果。使用適宜的濾光片以允許觀察阿霉素的自發(fā)熒光(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm；紅色熒光)。結(jié)果顯示出所有微細(xì)胞發(fā)射亮紅色熒光，表明阿霉素已經(jīng)轉(zhuǎn)移至微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，盡管使用攪拌式細(xì)胞超濾系統(tǒng)進(jìn)行了大量洗滌，阿霉素仍不能擴(kuò)散出微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這是令人驚奇的，因?yàn)樵谙礈觳襟E中，阿霉素的濃度梯度已經(jīng)逆轉(zhuǎn)，即微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的阿霉素濃度高于細(xì)胞外環(huán)境(BSG溶液)中的濃度。不用藥物培養(yǎng)的對(duì)照微細(xì)胞不能顯示出任何背景自發(fā)熒光。為了證實(shí)在微細(xì)胞中包裝的藥物不限于阿霉素，使用另一種癌癥化療藥物長(zhǎng)春堿進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)春堿在水中具有低溶解度。該藥物不能自發(fā)熒光；因此用偶聯(lián)B0DIPY-FL的長(zhǎng)春堿(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)，長(zhǎng)春堿的熒光類似物(激發(fā)波長(zhǎng)505nm，發(fā)射波長(zhǎng)513nm；紅色熒光)。用偶聯(lián)B0DIPY-FL的長(zhǎng)春堿如下包裝純化的微細(xì)胞首先將藥物溶于甲醇中(10mg/ml的母液)，按110稀釋于無(wú)菌PBS中，得到lmg/ml的母液。離心7xl09微細(xì)胞的BSG溶液，棄去上清液，將微細(xì)胞重新懸浮在940μ1BSG和60μ1偶聯(lián)B0DIPY-FL的長(zhǎng)春堿溶液(lmg/ml母液)。得到最終濃度為60μg藥物每Iml微細(xì)胞懸液。在37°C過(guò)夜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸液，以允許藥物擴(kuò)散進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。隨后經(jīng)超濾洗除過(guò)量藥物的步驟直至最終在BSG中重懸包裝藥物的微細(xì)胞的階段，然后用熒光顯微鏡觀察，這些與以上對(duì)阿霉素的描述相同。將包裝藥物的微細(xì)胞置于載玻片上，如上使用熒光顯微鏡觀察，使用LeicaDC相機(jī)和LeicaIM圖像管理軟件來(lái)捕獲結(jié)果。使用適當(dāng)?shù)臑V光片以允許觀察偶聯(lián)B0DIPY-FL的長(zhǎng)春堿的紅色熒光。結(jié)果顯示所有微細(xì)胞發(fā)射亮紅色熒光，表明藥物已經(jīng)轉(zhuǎn)移至微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，與對(duì)阿霉素的觀察相似，使用攪拌式細(xì)胞超濾系統(tǒng)的大量洗滌步驟沒(méi)有導(dǎo)致藥物從微細(xì)胞中流出至細(xì)胞外液。這也是令人驚奇的，因?yàn)橐话阌^念認(rèn)為僅有高親水性溶質(zhì)可經(jīng)由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，可能是通過(guò)細(xì)菌膜的孔蛋白通道。然而，此處的結(jié)果顯示出即使不是高親水性藥物也能擴(kuò)散穿過(guò)無(wú)生命的細(xì)菌細(xì)胞衍生物例如微細(xì)胞的膜。沒(méi)有用藥物培養(yǎng)的對(duì)照微細(xì)胞沒(méi)有顯示出任何背景自發(fā)熒光。實(shí)施例2.疏水性癌癥化療藥物紫杉醇在細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞中的有效包裝該實(shí)施例闡述疏水性藥物可包裝入細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。因?yàn)槲⒓?xì)胞表面膜由磷脂雙層組成，不預(yù)期高疏水性藥物將擴(kuò)散穿過(guò)這一屏障。Taxol(紫杉醇；Bristol-MyersSquibbCompany的注冊(cè)商標(biāo))為最初從太平洋沿岸紫杉樹的樹皮中分離的三環(huán)雙萜，最近從西方紫杉樹Taxusbrevifolia的針葉中也分離出紫杉醇。紫杉醇為最重要的化療劑之一，具有有前景的抗腫瘤活性，尤其能抗卵巢癌、乳癌和肺癌(MekhailandMarkman，2002)。紫杉醇為一種抗有絲分裂劑，其以與微管蛋白異二聚體11的化學(xué)計(jì)量與微管蛋白結(jié)合，穩(wěn)定微管，并促進(jìn)高百分比的細(xì)胞停止在(}2肩期，在細(xì)胞周期中緩慢進(jìn)行而無(wú)胞質(zhì)分裂，形成多核多倍體細(xì)胞，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。紫杉醇具有0.00025mg/ml的極低的水溶性，必須溶于某些共溶劑中，例如50%CremophoreEL和50%乙醇。為了證實(shí)疏水性藥物如紫杉醇可轉(zhuǎn)移進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，使用紫杉醇的熒光衍生物，偶聯(lián)OregonGreen488的紫杉醇(MolecularProbes,Eugene,OR,USA；吸收波長(zhǎng)496nm，發(fā)射波長(zhǎng)524nm)。采用兩種不同的方法溶解藥物(i)溶于乙醇中(得到7.58mM母液)，和(ii)溶于乙醇cremophoreEL(11體積/體積；3.79mM母液)。將每種母液1:10(體積/體積)稀釋于PBS中，分別得到758μM和379μM的母液。將后一種母液按120稀釋加入微細(xì)胞懸液(IO9微細(xì)胞)，得到偶聯(lián)OregonGreen488的紫杉醇在微細(xì)胞細(xì)胞外環(huán)境中的溶液，最終濃度分別為40μΜ和20μΜ。在37°C用藥物過(guò)夜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)微細(xì)胞，然后如用于阿霉素和長(zhǎng)春堿的實(shí)施例1中的描述使用超濾法來(lái)洗滌。也如實(shí)施例1中的描述，重懸微細(xì)胞并用熒光顯微法觀察。結(jié)果顯示所有微細(xì)胞發(fā)射亮綠色熒光，表明兩種方法都能實(shí)現(xiàn)紫杉醇經(jīng)由微細(xì)胞膜從細(xì)胞外環(huán)境中轉(zhuǎn)移并進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這是令人驚奇的，因?yàn)闆](méi)有預(yù)期高疏水性藥物能經(jīng)由微細(xì)胞的磷脂雙層(疏水的)膜擴(kuò)散進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)。另外，與在實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)中觀察到的類似，在大量洗滌步驟期間滲透壓梯度的逆轉(zhuǎn)沒(méi)有導(dǎo)致藥物流出微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。實(shí)施例1和2中的結(jié)果證實(shí)，上述的簡(jiǎn)單技術(shù)可用于方便地包裝親水性和疏水性藥物進(jìn)入藥物遞送載體。實(shí)施例3.確定細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞中藥物濃度的方法該實(shí)施例證明了確定細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞中藥物濃度的方法。更具體而言，該實(shí)施例描述了確定存在于微細(xì)胞·中的阿霉素濃度的方法，并證明了阿霉素濃度對(duì)加載溶液的影響。將包裝藥物的微細(xì)胞施用于治療目的需要有表征包裝藥物實(shí)體的能力，包括確定包裝藥物的量。然而，以前不存在有效地破壞細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞并提取包裝的藥物分子的方法。下面使用的縮略語(yǔ)包括(i)HCl鹽酸(BDHARMERCK,Australia),(ii)MeCN；乙腈，殺蟲劑殘留級(jí)(Burdick&Jackson,MI,USA),(iii)IEA；異丙醇或2_丙醇，殺蟲劑殘留級(jí)(Burdick&Jackson)，MQ;MilliQ純化的RO水(R彡IO18Ω)，C18&RP18；指在色譜柱中存在的固定相填料化學(xué)性質(zhì)(在這種情況下，其為鍵合到5微米(μπι)直徑硅膠顆粒的硅醇端基上的18個(gè)碳長(zhǎng)的烴鏈)，(iv)HPLC&LC；高效液相色譜，(v)MS；質(zhì)譜，(vi)堅(jiān)ZMS；碰撞誘導(dǎo)選定母離子片段化以產(chǎn)生確定的子離子(可用于消除基質(zhì)效應(yīng)和增加信/噪比)，(vii)ESi；電噴霧源離子化(在MS入口頭部的熱氣流噴霧中產(chǎn)生離子流)。在終濃度為5、10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200和250μg/mL的阿霉素溶液中分別培養(yǎng)IO9完整微細(xì)胞。在37°C過(guò)夜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)混合物。在13，200rpm/5分鐘離心收集微細(xì)胞，重懸在無(wú)菌BSG中。將微細(xì)胞懸液置于Amicon過(guò)濾室中(0.2μm孔大小)，共洗滌10次，每次洗滌用IOmlBSG0收集微細(xì)胞，分成切108微細(xì)胞的雙份，用于提取阿霉素。在13，200rpm離心微細(xì)胞，棄去上清液。向每個(gè)沉淀中加入500μL的97mMHC1-IPA，然后進(jìn)行5輪循環(huán)的漩渦振蕩1分鐘并超聲處理1分鐘。加入MQ(500μL)，重復(fù)進(jìn)行渦旋1分鐘和超聲處理1分鐘的5次循環(huán)。在13，200rpm離心提取物5分鐘以沉淀碎片，將上清液轉(zhuǎn)移到HPLC150μL玻璃插入物和小管中。因?yàn)榘⒚顾刈园l(fā)熒光，如下開發(fā)并實(shí)施對(duì)提取藥物的基于HPLC熒光的分析。所述HPLC方法特征包括()流動(dòng)相IOOmM甲酸銨+0.05%三乙胺(pH=3.5)MQMeCNS^4230ilmL/min,(ii)固定相:MerckLichrosphereRP18，5μm，4.0mmx250mm，(iii)柱溫:40°C，(iv)注射體積15μL，(iv)檢Μ熒光激發(fā)波長(zhǎng)480nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm，(ν)HPLC系統(tǒng)使用Shimadzu10AVP系統(tǒng)，其包含自動(dòng)進(jìn)樣器、溶劑脫氣裝置、四元泵、柱加熱器(40°C)和熒光檢測(cè)器，運(yùn)行版本7.2SPIrevB軟件。ShimadzuCorporation(KyotoJapan)。同時(shí)使用HPLC和LC-MS進(jìn)行阿霉素的測(cè)量以證實(shí)數(shù)據(jù)的可靠性。LC-MS操作和關(guān)鍵特征包括(i)流動(dòng)相5mM甲酸銨(pH=3.5)MeCN=7624i0.2mL/min,(ii)固定相PhenomenexLunaC18(2),5μm,2.0mmxl50mm,(iii)柱溫30°C，(iv)注射體積2μL，(ν)LC禾口MS系統(tǒng)=LC和MS系統(tǒng)都來(lái)自Thermo-Finnigan(Boston，MA,USA)。所述LC系統(tǒng)包含有集成了柱加熱器和泵的自動(dòng)進(jìn)樣器。柱洗脫液直接轉(zhuǎn)移至Thermo-FirmiganLCQ-Deca離子阱質(zhì)譜儀電噴霧離子化源，(vi)檢測(cè)=MS檢測(cè)器以陽(yáng)離子模式和MS/MS掃描方式工作。母離子設(shè)置在m/z=M3.9，在m/z=396.8產(chǎn)生子離子。追蹤子離子以用于定量目的。將三次熒光測(cè)定和MS結(jié)果標(biāo)繪在一起(圖1)，以指示它們的等價(jià)的[D0X]測(cè)定(在測(cè)量的誤差棒內(nèi))。結(jié)果表明從微細(xì)胞_提取的阿霉素濃度和阿霉素的外部加載濃度之間的明確的相關(guān)性。重復(fù)這些試驗(yàn)3次，得到類似的結(jié)果。另外，修改該技術(shù)用于測(cè)定其它包裝入完整微細(xì)胞的化療藥物例如紫杉醇、依立替康、5-氟尿嘧啶和順鉬的濃度。實(shí)施例4.藥物以及表面配體結(jié)合不引起微細(xì)胞不穩(wěn)定或失去包埋的膜結(jié)構(gòu)該實(shí)施例證明了藥物在微細(xì)胞中包裝和配體結(jié)合至包裝藥物的微細(xì)胞的表面不會(huì)引起微細(xì)胞不穩(wěn)定、藥物滲漏或喪失微細(xì)胞膜包埋的結(jié)構(gòu)。結(jié)果是令人驚奇的，因?yàn)轭A(yù)期細(xì)胞質(zhì)中的藥物、尤其是高毒性的化療藥物將使微細(xì)胞雙層膜不穩(wěn)定。設(shè)計(jì)研究用于確定是否藥物包裝在微細(xì)胞中和/或雙特異性配體結(jié)合至表面結(jié)構(gòu)(例如LPS的0-抗原組分)將引起藥物漏出和/或喪失具有雙特異性配體的微細(xì)胞雙層包埋的結(jié)構(gòu)(例如，LPS脫落)。如上所述用阿霉素(DOX)或偶聯(lián)OregonGreen488的紫杉醇(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)包裝微細(xì)胞(5xl08)。如在實(shí)施例3中的描述，確定微細(xì)胞腿和微細(xì)胞Pa。中的藥物濃度，結(jié)果表明，分別為425ngDOX和M5ng紫杉醇。如PCT/US2004/041010所述構(gòu)建具有抗-鼠傷寒沙門氏菌0_抗原和抗-EGFR特異性的BsAb。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)將抗-鼠傷害沙門氏菌0-抗原的單克隆抗體(MAb)(IgGl；Biodesign)和抗靶細(xì)胞表面受體的MAb連接來(lái)構(gòu)建雙特異性抗體(BsAb)，所述MAb是小鼠抗人EGFR(IgG2a；Oncogene)或小鼠抗人HER2/neu受體(IgGl；Serotec)。兩種抗體經(jīng)由它們的Fc區(qū)域用純化的重組蛋白A/G(PierceBiotechnology)來(lái)交聯(lián)。簡(jiǎn)而言之，將蛋白A/G(100μg/ml終濃度)加入到0.5ml的包含各自20μg/ml抗-鼠傷寒沙門氏菌0-抗原和抗人EGFRMAbs的預(yù)混溶液中，在4°C培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)與偶聯(lián)蛋白G的磁珠一起孵育并在室溫下輕輕混合40分鐘來(lái)除去過(guò)量抗體。在磁性分離磁珠后，在室溫下，將蛋白A/G-BsAb復(fù)合物與切108包裝藥物的微細(xì)胞一起培養(yǎng)1小時(shí)，通過(guò)使0-抗原特異性Fab臂結(jié)合至表面LPS上來(lái)用抗體包被它們。使用Alexa-Flour488(分子探針；綠色熒光)或AlexaFluor594(分子探針；紅色熒光)來(lái)偶聯(lián)BsAb。將微細(xì)胞MX與偶聯(lián)Alexa-Flour488⑧的BsAb混合，將微細(xì)胞^。與偶聯(lián)AlexaFluor594的BsAb混合。使用Leica熒光顯微鏡，使用IOOx物鏡和適用于紅色和綠色熒光的濾光片，觀察各種微細(xì)胞制備物。結(jié)果表明BsAb與微細(xì)胞DQX和微細(xì)胞&。表面結(jié)合很強(qiáng)，似乎形成環(huán)繞微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的完整環(huán)。在微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也觀察到各自的藥物阿霉素和紫杉醇。如上所述從微細(xì)胞中提取藥物，并確定藥物濃度。與—微細(xì)胞腿和—微細(xì)胞Pa。相比，微細(xì)胞腿和微細(xì)胞Pac中的藥物濃度相同(即分別為425ng阿霉素和M5ng紫杉醇)。使用其它的BsAbs，例如抗-0-抗原/抗HER2/neu得到類似的結(jié)果。這表明該方法與開發(fā)安全的藥物遞送載體相容，因?yàn)樗幬锇b和BsAb結(jié)合沒(méi)有導(dǎo)致載體不穩(wěn)定或藥物從完整微細(xì)胞漏出。實(shí)施例5.經(jīng)過(guò)配體靶向和包裝阿霉素的微細(xì)胞將阿霉素體外靶向遞送至非吞噬性人腦癌細(xì)胞該實(shí)施例證明包裝在載有結(jié)合細(xì)胞表面的雙特異性配體的完整微細(xì)胞中的化療藥物阿霉素，可(a)特異性結(jié)合至非吞噬性哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞表面，人腦癌細(xì)胞的EGF受體，和(b)在內(nèi)吞并破壞包裝阿霉素的微細(xì)胞之后，細(xì)胞內(nèi)遞送藥物至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如實(shí)施例1中的描述，純化鼠傷寒沙門氏菌min⑶E-來(lái)源的微細(xì)胞，并用阿霉素包裝。如上述和美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/602,021中所述以及在實(shí)施例4中簡(jiǎn)要描述，構(gòu)建雙特異性抗體。選擇抗-EGFR單克隆抗體，因?yàn)榇郎y(cè)試的靶細(xì)胞是人腦癌細(xì)胞U87_MG(ATCC，Rockville,MD,USA；人惡性星形細(xì)胞瘤上皮細(xì)胞系)，已知其在細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)EGF受體。用熒光染料標(biāo)記雙特異性抗體，以通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡能觀察和跟蹤靶向的微細(xì)胞。操作如下。使用AlexaFluor488蛋白標(biāo)記試劑盒(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)來(lái)標(biāo)記雙特異性抗體。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，經(jīng)過(guò)雙特異性抗體的游離氨基來(lái)偶聯(lián)AlexaFluor488染料(吸收波長(zhǎng)494nm，發(fā)射波長(zhǎng)519nm；綠色熒光)。U87-MG星形細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于12孔組織培養(yǎng)板(Cellstar；GreinerBio-OneGmbH,Frickenhausen,Germany)中的15mm蓋玻片上。細(xì)胞生長(zhǎng)于含5%cosmic牛血清(Hyclone,Logan,UT,USA)和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37°C、5%CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至40%匯合，如下處理四組孔(a)未處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，(b)IO8非靶向的空微細(xì)胞，(c)IO8靶向的空微細(xì)胞，(d)IO8非靶向包裝阿霉素的微細(xì)胞，和(e)IO8靶向的包裝阿霉素的微細(xì)胞。8小時(shí)后終止每個(gè)樣品2孔中的培養(yǎng)反應(yīng)，24小時(shí)后終止剩余的兩個(gè)樣品。培養(yǎng)后，用PBS洗滌細(xì)胞4次，用4%甲醛固定10分鐘。用PBS洗滌固定劑三次，將蓋玻片翻轉(zhuǎn)在含甘油的玻璃載玻片上。用瓊脂糖密封蓋玻片。用熒光共聚焦顯微鏡(Fluoview，OlympusAmerica,Melville,NY,USA)觀察載玻片。收集熒光和微分相差(differentialimagecontrast)(DIC)圖像，結(jié)果表明在8小時(shí)的培養(yǎng)內(nèi)，靶向(載有偶聯(lián)AlexaFluor488的雙特異性抗體；綠色熒光)包裝阿霉素的微細(xì)胞顯示大多數(shù)細(xì)胞被幾個(gè)綠色熒光點(diǎn)覆蓋，而非靶向(缺少熒光標(biāo)記的雙特異性抗體)微細(xì)胞僅在非常少的細(xì)胞上顯示有一些綠色熒光點(diǎn)。這表明雙特異性抗體能特異性地使包裝阿霉素的微細(xì)胞強(qiáng)烈粘附至星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的表面，這可能是經(jīng)由EGF受體。共培養(yǎng)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞和包裝阿霉素的微細(xì)胞(靶向和非靶向)M小時(shí)后，當(dāng)用紅色熒光(阿霉素自發(fā)熒光是紅色)觀察時(shí)，結(jié)果顯示出大多數(shù)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面上帶有強(qiáng)紅色熒光點(diǎn)，并且許多細(xì)胞顯示在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有擴(kuò)散的紅色熒光，這通過(guò)用熒光共聚焦顯微鏡觀察跨細(xì)胞切片來(lái)確定。這一結(jié)果與未靶向的包裝阿霉素的微細(xì)胞和星形細(xì)胞瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的結(jié)果形成對(duì)照，其中僅在少數(shù)細(xì)胞上觀察到少量紅色熒光點(diǎn)(非特異性粘附微細(xì)胞)。這表明許多包裝阿霉素的微細(xì)胞已經(jīng)被內(nèi)化，最可能是經(jīng)由EGF受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，并且表明某些微細(xì)胞已經(jīng)破裂并釋放阿霉素進(jìn)入星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。該結(jié)果還進(jìn)一步被確認(rèn)，當(dāng)綠色熒光和紅色熒光圖像重疊時(shí)，顯示出大多數(shù)的綠色點(diǎn)與紅色點(diǎn)共定位，而產(chǎn)生了黃色點(diǎn)。在星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)早期觀察到的擴(kuò)散紅色熒光仍然保持紅色，表明阿霉素(紅色自發(fā)熒光)不再包裝在微細(xì)胞(微細(xì)胞表面定位的雙特異性抗體顯示綠色)內(nèi)，進(jìn)一步提示一些已經(jīng)被內(nèi)吞的微細(xì)胞破裂，并釋放阿霉素進(jìn)入星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞質(zhì)中。實(shí)施例6.微細(xì)胞介導(dǎo)的藥物遞送至非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的效率該實(shí)驗(yàn)證明微細(xì)胞介導(dǎo)的藥物遞送至非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的效率。使用比色法細(xì)胞毒性測(cè)試(Promega;CellTiter96AqueousOne)。用EGFK微細(xì)胞DQX或包含游離阿霉素和Φ^微細(xì)胞d()x的對(duì)照處理MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞。將MDA-MB468細(xì)胞種在5Χ106細(xì)胞的Τ75燒瓶中，培養(yǎng)48小時(shí)，得到IXlO7細(xì)胞/瓶。改變培養(yǎng)基，用IO9微細(xì)胞^或^^微細(xì)胞^處理細(xì)胞。也包括游離的阿霉素(50ng/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，用更換PBS共3次來(lái)洗滌，用胰蛋白酶消化。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。將每孔IXlO4細(xì)胞/ml等分至24-孔板中(每種處理6孔)，培養(yǎng)3、4、5和6天，每天改換培養(yǎng)基。根據(jù)制造廠家的使用說(shuō)明，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTS測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，將100μL的MTS試劑加入到每孔中，在2.5小時(shí)至4小時(shí)監(jiān)測(cè)顏色變化。從每孔中取出100μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，在490nm讀取吸光度。結(jié)果顯示(圖2)EeFK微細(xì)胞胃的細(xì)胞毒性類似于游離阿霉素的毒性，這提示—微細(xì)胞遞送活性形式的阿霉素至MDA細(xì)胞，藥物遞送的效率超過(guò)95%。微細(xì)胞DQX對(duì)癌細(xì)胞沒(méi)有顯示出任何毒性，表明靶向機(jī)理對(duì)于基于微細(xì)胞的藥物治療的安全性是重要的，因?yàn)榉峭淌尚圆溉閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出非特異性內(nèi)吞微細(xì)胞。實(shí)施例7.經(jīng)由靶向和包裝藥物的微細(xì)胞將化療藥物阿霉素高效遞送給裸鼠中人乳腺癌異種移植物該實(shí)施例證實(shí)了雙特異性配體靶向的和包裝阿霉素的完整微細(xì)胞可使人乳腺癌細(xì)胞腫瘤異種移植物退化，所述腫瘤異種移植物建立于6周齡雌性無(wú)胸腺裸鼠中。如上所述，從鼠傷寒沙門氏菌minCDE-突變株得到微細(xì)胞，并使用梯度離心/成絲作用/過(guò)濾/去除內(nèi)毒素方法純化。如實(shí)施例1的描述，純化的微細(xì)胞用化療藥物阿霉素包裝。如實(shí)施例3描述構(gòu)建雙特異性抗體。選擇抗-EGFR單克隆抗體，因?yàn)楫惙N移植物細(xì)胞為人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，已知其在細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)EGF受體。室溫下，用蛋白A/G-雙特異性抗體與重組的微細(xì)胞(101°)共同培養(yǎng)1小時(shí)，經(jīng)由抗-LPSFab區(qū)用抗體包被微細(xì)胞。歹Ij中iiffi的/]、鼠_自AnimalResourcesCentre,Perth,WA,Australia,所有的動(dòng)物試驗(yàn)都在符合試驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南規(guī)定并經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。這些試驗(yàn)都在EnGeneICPtyLtd(Sydney,NSW,Australia)的NSWAgriculture認(rèn)證的小動(dòng)物設(shè)施中進(jìn)行。于37°C下，在95%空氣和5%CO2的濕空氣中，在T-75培養(yǎng)瓶中，使組織培養(yǎng)中的人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468，ATCC；人乳房上皮細(xì)胞；非吞噬細(xì)胞)生長(zhǎng)至完全匯合，其中培養(yǎng)瓶中含有添加5%小牛血清(GIBCO-BRLLifeTechnologies,InvitrogenCorporation，Carlskid，CA，USA)和谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基。使用23號(hào)針將IxlO6細(xì)胞的50uL無(wú)血清培養(yǎng)基和50uL生長(zhǎng)因子減少的matrigel(BDBiosciences,FranklinLakes，NJ，USA)皮下注射入每個(gè)小鼠的肩胛骨之間。使用電子數(shù)字測(cè)徑器(Mitutoyo，Japan，精確至0.001)每周測(cè)量腫瘤兩次，使用公式，長(zhǎng)(mm)χ寬2(mm)X0.5=體積(mm3)，計(jì)算平均腫瘤體積。植入后16天，腫瘤達(dá)到體積50mm3至80mm3，將小鼠隨機(jī)分在7個(gè)不同的組中，每組11只。如下設(shè)計(jì)該試驗(yàn)。組1(對(duì)照)不接受處理。組2(對(duì)照)接受瘤內(nèi)給予游離的阿霉素(5μg/g小鼠體重)。包含該對(duì)照組來(lái)確定游離阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，并評(píng)價(jià)毒性副作用。組3(對(duì)照)與組2相同，不同在于靜脈內(nèi)給予阿霉素。組4(對(duì)照)接受靜脈給予抗-0抗原/抗-EGFRBsAb和游離阿霉素，來(lái)顯示在缺少微細(xì)胞下BsAb的影響。組5和組6分別接受靜脈和瘤內(nèi)給予微細(xì)胞·，以確定包裝藥物但非靶向的微細(xì)胞是否能使腫瘤穩(wěn)定。組7和組8分別接受靜脈和瘤內(nèi)給予EGFR-靶向的■微細(xì)胞腿，以確定受體靶向的、包裝藥物的微細(xì)胞是否能使腫瘤穩(wěn)定。包含組8來(lái)確定尾靜脈給予靶向的、包裝阿霉素的微細(xì)胞(該微細(xì)胞符合需要的序列事件)能否遵從實(shí)現(xiàn)腫瘤穩(wěn)定和/或退化需要的一系列事件即，在腫瘤部位滲透滲漏的脈管系統(tǒng)(肩胛骨區(qū)域)，擴(kuò)散穿過(guò)腫瘤微環(huán)境，特異性結(jié)合人乳癌細(xì)胞，被細(xì)胞內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)破壞，和將生物活性形式的負(fù)載藥物釋放入癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而使腫瘤穩(wěn)定化和/或退化。以IO8的劑量給予微細(xì)胞，所有治療都在異種移植物建立后17、24、27和56天給予。由對(duì)給藥處理不知情的調(diào)查者進(jìn)行所有測(cè)量。通過(guò)變異分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(ANOVA)，P<0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。22結(jié)果顯示(圖3)僅有用EeFK微細(xì)胞·處理中觀察到高度顯著的(p=0.0004)腫瘤穩(wěn)定/退化，無(wú)論靜脈內(nèi)給藥還是瘤內(nèi)給藥都是如此。用·1^微細(xì)胞沒(méi)有觀察到腫瘤退化，提示BsAb-介導(dǎo)的靶向作用是很重要的。在第63天，用微細(xì)胞·處理的組改換用EGFE微細(xì)胞腿處理，以確定經(jīng)由靶向治療是否大的腫瘤體積(800mm3至1，200mm3)可退化。結(jié)果為劇烈地腫瘤退化；第79天，僅僅兩種EeFK微細(xì)胞麗處理，腫瘤體積退化為IOOmm3至150mm3。全部試驗(yàn)進(jìn)行3次，每次都得到類似的結(jié)果。這表明BsAb-靶向微細(xì)胞能特異性遞送化療藥物至體內(nèi)人腫瘤異種移植物。結(jié)果第一次證實(shí)，通過(guò)細(xì)菌來(lái)源的完整的包裝藥物的微細(xì)胞，體內(nèi)靶向藥物遞送至非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。有趣的是，小鼠尾靜脈給予游離的阿霉素(組3和組4)在注射部位出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)，這是游離阿霉素靜脈注射給人時(shí)眾所周知的副作用。該反應(yīng)，稱為Wilebitis，被認(rèn)為是藥物在注射部位外滲引起的，伴有殺死局部區(qū)域的正常細(xì)胞。相反，給予靶向或非靶向的包裝阿霉素的微細(xì)胞的小鼠在注射部位沒(méi)有顯示出任何副反應(yīng)，提示微細(xì)胞包裝的阿霉素防止了游離阿霉素與注射部位的皮膚組織的反應(yīng)。另外，與脂質(zhì)體遞送載體例如DOXIL(脂質(zhì)體阿霉素)不同，藥物不能從微細(xì)胞漏出。這些結(jié)果提示以下內(nèi)容(a)微細(xì)胞能將潛在高毒性藥物如阿霉素包裝在微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，藥物不會(huì)出現(xiàn)從微細(xì)胞膜漏出。因此，缺少對(duì)尾靜脈注射部位的皮膚反應(yīng)性(組5和7)，而使用游離阿霉素(組3和組4)可見(jiàn)到該反應(yīng)性，(b)當(dāng)將微細(xì)胞靜脈或瘤內(nèi)注射時(shí)，包裝阿霉素的微細(xì)胞至少對(duì)裸鼠是安全的，提示本發(fā)明人以前發(fā)明(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IB02/04632)并在此采用的去除內(nèi)毒素(脂多糖)方法足以提供基本無(wú)內(nèi)毒素的微細(xì)胞劑量，這對(duì)靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)皮下給藥是安全的，(c)靶向微細(xì)胞似乎足夠小，可以滲透過(guò)滲漏的腫瘤新血管系統(tǒng)，致使包裝阿霉素的微細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，(d)靶向的包裝阿霉素的微細(xì)胞似乎特異性結(jié)合EGF受體，已知該受體在MDA-MB-468細(xì)胞的表面過(guò)表達(dá)；在被內(nèi)吞后，微細(xì)胞破壞并釋放阿霉素，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡并觀察到腫瘤退化(組7；圖3)，(e)靜脈注射以后，靶向的和包裝阿霉素的微細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)腫瘤退化的顯著濃度達(dá)到腫瘤微環(huán)境。相應(yīng)地，微細(xì)胞似乎不會(huì)被循環(huán)的專門吞噬性細(xì)胞以顯著量消除，從而消除觀察到的治療效果。實(shí)施例8.疏水性化療藥物紫杉醇經(jīng)由靶向和包裝藥物的微細(xì)胞向裸鼠中人乳腺癌異種移植物的高效遞送該實(shí)施例證實(shí)了疏水性化療藥物紫杉醇經(jīng)由靶向和包裝藥物的微細(xì)胞向裸鼠中人乳腺癌異種移植物的高效遞送。使用微細(xì)作為試驗(yàn)處理重復(fù)實(shí)施例7中的試驗(yàn)。處理包括(i)Gl-僅僅腫瘤，(ii)G2-瘤內(nèi)給予游離紫杉醇GOOyg)，(iii)G3-靜脈給予游離紫杉醇GOOyg)，(iv)G4-靜脈給予抗-0抗原/抗-EGFRBsAb和游離紫杉醇(400ug),(v)G5-靜脈給予微細(xì)胞Pa。，(vi)G6-瘤內(nèi)給微細(xì)胞&。，(vii)G7_靜脈內(nèi)給予■微細(xì)胞Pac，(Viii)GS-瘤內(nèi)給予■微細(xì)胞^。。在第15、21、26、四和33天給予多種處理。在每次微細(xì)胞處理中使用IxlO8微細(xì)胞。結(jié)果顯示(圖4)用EeFK微細(xì)胞Pa。處理的小鼠中高度顯著性(p=0.0004)腫瘤穩(wěn)定/退化，并且再一次證實(shí)與靜脈內(nèi)給予或瘤內(nèi)給予無(wú)關(guān)。包括微細(xì)胞Pa。、BsAb和游離紫杉醇的對(duì)照處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有可以忽略的作用。整個(gè)試驗(yàn)中，小鼠沒(méi)有顯示出任何明顯的中毒征兆，如發(fā)熱、昏睡、食欲降低或死亡。重復(fù)3次該試驗(yàn)，得到類似的結(jié)果。這一結(jié)果特別顯著，因?yàn)槠渌乃幬镞f送載體例如脂質(zhì)體、納米顆粒等不能成功地包裝治療有效量的高疏水性藥物例如紫杉醇。在大多數(shù)情況下，進(jìn)行嘗試來(lái)改變載體或藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)以使能夠包裝藥物，經(jīng)常導(dǎo)致喪失生物活性。我們的結(jié)果是首次顯示出不僅這樣的藥物易于包裝在完整微細(xì)胞中，而且它們能安全地特異性遞送至體內(nèi)的疾病靶細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)治療作用。實(shí)施例9.證明基于靶向微細(xì)胞的藥物遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多樣性該實(shí)施例證明(i)靶向的包裝藥物的微細(xì)胞載體具有足夠多樣性，可以在廣泛的不同的非吞噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)治療作用，(ii)靶向機(jī)制具有足夠多樣，足以能使用疾病細(xì)胞上的不同細(xì)胞表面受體靶，而不限于EGF受體，和(iii)微細(xì)胞載體自身是多樣的，足以能使用來(lái)源于不同細(xì)菌屬的微細(xì)胞。在單個(gè)裸鼠異種移植物試驗(yàn)中，(i)使用人卵巢癌細(xì)胞(SK0V3；ATCC.USA)建立腫瘤異種移植物，()使用抗-0-抗原MAb和抗HER2/neuMAb(已知后一種受體在SK0V3細(xì)胞表面過(guò)表達(dá))構(gòu)建打靶BsAbJP(iii)用于治療的微細(xì)胞來(lái)源于鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌min⑶E-株。微細(xì)胞用阿霉素包裝。微細(xì)胞DQX、BsAb(抗-HER2/抗-0抗原)和游離阿霉素包括在內(nèi)，作為對(duì)照。結(jié)果顯示(圖5)在用鼠傷寒沙門氏菌min⑶E-或大腸桿菌min⑶E-來(lái)源的HEK2微細(xì)胞DQX處理的小鼠中顯著的腫瘤穩(wěn)定化(P=0.004)。I0V3異種移植物比MDA-MB-468異種移植物生長(zhǎng)快得多，該試驗(yàn)僅能在建立異種移植物后持續(xù)31天，因?yàn)閷?duì)照動(dòng)物已經(jīng)達(dá)到死亡點(diǎn)或處以安樂(lè)死。這些結(jié)果證實(shí)(i)完整微細(xì)胞可用于體內(nèi)遞送藥物至廣泛的不同的非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，(ii)完整微細(xì)胞載體可靶向至在疾病細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的多樣范圍的細(xì)胞表面受體，和(iii)微細(xì)胞可來(lái)源于不同的細(xì)菌屬或種，然而以相似方式起作用，特別是對(duì)于藥物遞送至體內(nèi)靶向細(xì)胞來(lái)說(shuō)。實(shí)施例10.靶向、包裝藥物的微細(xì)胞劑量和對(duì)裸鼠中人腫瘤異種移植物治療作用之間的相互關(guān)系該實(shí)施例證實(shí)包裝藥物的微細(xì)胞的劑量-效應(yīng)關(guān)系。更具體而言，該實(shí)施例顯示，為實(shí)現(xiàn)對(duì)裸鼠中人腫瘤異種移植物的最大治療作用所需要的、靶向的、包裝藥物的微細(xì)胞的劑量。在Balb/cnu/nu小鼠肩胛骨之間建立MDA-MB_468(人乳腺癌)細(xì)胞作為異種移植物。如實(shí)施例3所述，使用兩種不同的外部阿霉素濃度60μg/ml和200μg/ml，用阿霉素包裝鼠傷寒沙門氏菌minCDE-來(lái)源的微細(xì)胞。純化微細(xì)胞胃(實(shí)施例1)，并通過(guò)HPLC分析試樣，來(lái)確定包裝入IO8微細(xì)胞的阿霉素濃度。結(jié)果顯示外部阿霉素濃度為60μg/ml和200μg/ml情況下，IO8微細(xì)胞分別包裝85ng和660ng阿霉素。然后將微細(xì)胞DQX靶向至EGFR，其中EGFR在MDA-MB-468細(xì)胞上過(guò)表達(dá)，制備六種不同的小鼠靜脈注射劑量，(i)GI-IO8egfk微細(xì)胞DQX，載有總量660ng的阿霉素，(ii)G2_108EGFK微細(xì)胞DQX，載有總量85ng的阿霉素，(iii)G3-107EGFK微細(xì)胞DQX，載有總量66ng的阿霉素，(iv)G4-107EGFE微細(xì)胞腿，載有總量8.5ng的阿霉素，(v)G5-106EGFE微細(xì)胞麗，載有總量6.6ng的阿霉素，和(vi)G6-106■微細(xì)胞DQX，載有總量0.85ng的阿霉素。建立腫瘤體積為2450mm3至SOmm3的異種移植物后，靜脈給予小鼠不同劑量。如前所述測(cè)量腫瘤體積。結(jié)果顯示(圖6)微細(xì)胞劑量和治療效果之間的明確關(guān)系。就腫瘤穩(wěn)定/退化來(lái)說(shuō)，IO8EGFE微細(xì)胞腿比IO7EGFE微細(xì)胞腿更加有效，依次又比IO6EGFE微細(xì)胞腿更加有效。有趣的是，在向組3和組4(分別為6.6ng和8.5ng)與組5和組6(66ng和85ng)給予的微細(xì)胞之間阿霉素濃度沒(méi)有較大差異。然而，G4中的處理比G3中的處理更有效，類似地，G6中的處理比G5中的處理更有效。這提示在該試驗(yàn)中分析的微細(xì)胞和藥物濃度的范圍內(nèi)，相對(duì)于微細(xì)胞內(nèi)載有的藥物濃度，治療效果與微細(xì)胞的數(shù)量更相關(guān)。特別地，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案。1.組合物，其包含(i)含有藥物分子的完整微細(xì)胞和(ii)其藥學(xué)上可接受的載體。2.1的組合物，其中所述組合物含有每IO7微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。3.1的組合物，其中所述組合物含有每IO8微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。4.1的組合物，其中所述組合物含有每IO9微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。5.1的組合物，其中所述組合物含有每IOltl微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。6.1的組合物，其中所述組合物含有每IO11微細(xì)胞少于約1個(gè)污染的親代細(xì)菌細(xì)胞。7.組合物，其基本上由含藥物分子的完整微細(xì)胞組成。8.靶向藥物遞送方法，其包括使雙特異性配體接觸(a)含藥物分子的細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞和(b)哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，使得(i)所述雙特異性配體引起所述微細(xì)胞結(jié)合至所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，(ii)所述微細(xì)胞被所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入，和(iii)所述藥物被釋放入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。9.8的方法，其中所述哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞為非吞噬性細(xì)胞。10.8的方法，其中所述雙特異性配體包含多肽或糖或糖肽。11.8的方法，其中所述雙特異性配體包含第一臂和第二臂，第一臂載有對(duì)細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的特異性，第二臂載有對(duì)非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面受體的特異性。12.11的方法，其中所述第一臂和所述第二臂是單一特異性的。13.11的方法，其中所述第一臂和所述第二臂是多價(jià)的。14.11的方法，其中所述微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)是所述微細(xì)胞表面上的脂多糖中的0-多糖組分。15.11的方法，其中所述微細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)選自外膜蛋白、菌毛、纖毛、鞭毛和細(xì)胞表面暴露的糖。16.11的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面受體能活化所述微細(xì)胞的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。17.8的方法，其中所述雙特異性配體包含抗體或抗體片段。18.8的方法，其中所述雙特異性配體包含人源化抗體。19.8的方法，其中所述微細(xì)胞包含完整的細(xì)胞壁。20.8的方法，其中所述藥物為化療劑。21.8的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外。22.8的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)。23.8的方法，其中所述藥物編碼在所述微細(xì)胞內(nèi)含有的質(zhì)粒上。24.23的方法，其中所述質(zhì)粒包含調(diào)節(jié)元件。25.23的方法，其中所述質(zhì)粒包含報(bào)告元件。26.藥物遞送方法，其包括使包含藥物的細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞有吞噬作用或有胞吞作用的能力，使得所述微細(xì)胞被所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞吞入，且所述藥物釋放入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。27.26的方法，其中所述微細(xì)胞包含完整的細(xì)胞壁。28.26的方法，其中所述藥物是化療劑。29.26的方法，其中所述微細(xì)胞在體外。30.26的方法，其中所述微細(xì)胞在體內(nèi)。31.26的方法，其中所述藥物編碼在所述微細(xì)胞內(nèi)含有的質(zhì)粒上。32.31的方法，其中所述質(zhì)粒包含調(diào)節(jié)元件。33.31的方法，其中所述質(zhì)粒包含報(bào)告元件。34.用藥物負(fù)載微細(xì)胞的方法，其包括在含所述微細(xì)胞的細(xì)胞外介質(zhì)和微細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)之間創(chuàng)建濃度梯度的步驟，使得所述藥物沿所述濃度梯度下移，進(jìn)入微細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。35.用藥物負(fù)載微細(xì)胞的方法，包括步驟a)在一定條件下培養(yǎng)能產(chǎn)生微細(xì)胞的重組親代細(xì)菌細(xì)胞，使得所述親代細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼所述藥物的治療性核酸，使得所述藥物釋放入所述親代細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，然后b)允許所述親代細(xì)菌細(xì)胞形成一個(gè)或多個(gè)微細(xì)胞，其中所述微細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中含所述藥物。36.用藥物負(fù)載微細(xì)胞的方法，包括在一定條件下培養(yǎng)含有編碼所述藥物的治療性核酸的重組微細(xì)胞的步驟，使得所述的編碼所述藥物的治療性核酸在所述微細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯。37.組合物，包含⑴含藥物分子的細(xì)菌來(lái)源的微細(xì)胞和(ii)雙特異性配體，其能與所述微細(xì)胞的表面組分和非吞噬性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面組分結(jié)合。38.細(xì)菌來(lái)源的完整微細(xì)胞和雙特異性配體在制備藥物中的用途，所述微細(xì)胞含藥物分子且所述雙特異性配體能結(jié)合至所述微細(xì)胞和非吞噬性哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，通過(guò)將所述藥物施用于細(xì)胞、組織或器官，所述藥物用于治療疾病或改善性狀的方法。引用的出版物本申請(qǐng)經(jīng)引用并入以下出版物的每一種Albertsetal.，IntraperitonealcisplatinplusintravenouscyclophosphamideversusintravenouscisplatinplusintravenouscyclophosphamideforStageIIIovariancancer,N.Engl.J.Med.,3351950-1955(1996).Allenetal.，Chronicliposomeadministrationinmice:effectsonreticuloendothelialfunctionandtissuedistribution,J.Pharmacol.Exp.Therap.,229:267-275(1984).AllenTM,Liposomes!opportunitiesindrugdelivery,Drugs，54Suppl4:8-14(1997).Alkan-Onyukseletal.，Amixedmicellarformulationsuitablefortheparenteraladministrationoftaxol,Pharm.Res.,11(2):206-12(1994).Arndtetal.，Alkylphospholipidliposomes!preparation，propertiesanduseincancerresearch，DrugsofToday,34(Suppl.F):83-96(1998).Barenholz,Liposomeapplication:problemsandprospects，Curr.Opin.ColloidInterface.Sci.，6:66-77(2001).Batraetal.，Receptor-mediatedgenedeliveryemployinglectin-bindingspecificity,GeneTher.,1(4):255-60(1994).Beckeretal.，GenetherapyofprostatecancerwiththesolublevascularendothelialgrowthfactorreceptorFlkl,CancerBiol.Ther.,1(5):548-53(2002).Borges-Walmsley&Walmsley,Thestructureandfunctionofdrugpumps，TrendsMicrobiol.9:71-79(2001).Brittonetal.，"CharacterizationofaprokaryoticSMCproteininvolvedinchromosomepartitioning，，，GenesDev.,12:1254(1998).Carter,Improvingtheefficacyofantibody-basedcancertherapies,Nat.Rev.Cancer,1(2):118-29(2001).Chanetal.，ProspectiverandomizedtrialofdocetaxelversusDoxorubicininpatientswithmetastaticbreastcancer，J.Clin.Oncol.,172341-54(1999).Chonn&Cullis，Recentadvancesinliposomaldrug-deliverysystems,Curr·opinioninBiotechnology,6(6):698-708(1995).Cowanetal.，RandomizedtrialofDoxorubicin,bisantrene，andmitoxantroneinadvancedbreastcancer,J.Natl.CancerInst.,83:1077-84(1991).Cullisetal.，InfluenceofpHgradientsonthetransbilayertransportofdrugs，lipids，peptidesandmetalionsintolargeunilamellarvesicles,Biochim.Biophys.Acta，1331:187-211(1997)·Daemenetal.，LiposomalDoxorubicin-inducedtoxicity:depletionandimpairmentofphagocyticactivityoflivermacrophages，Int.J.Cancer,61716-721(1995).Daemenetal.，ToxicityofDoxorubicinentrappedwithinlong-circulatingliposomes,J.ControlledRelease，44:1-9(1997).deHaardetal.，Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies,J.Biol.Chem.，274:18218-18230(1999).DeMarioMDandRatainMI.Oralchemotherapy-rationaleandfuturedirections,J.Clin.Oncol.，16(7):2557-2567(1998)·Dubeletal.，Bifunctionalandmultimericcomplexesofstreptavidinfusedtosinglechainantibodies(scFv),J.Immunol.Methods,178:201-209(1995).Gabizonetal.，PharmacokineticsofpegylatedliposomalDoxorubicinreviewofanimalandhumanstudies,Clin.Pharmacokinet.,42:419-36(2003).Glennieetal.，PreparationandperformanceofbispecificF(ab/gamma)2antibodycontainingthioether-1inkedFab'gammafragments，J.Immunol.,139(7)2367-75(1987).Gosselin&Lee,Folatereceptor-targetedliposomesasvectorsfortherapeuticagents,Biotechnol.Annu.Rev.，8:103-31(2002).Gregoriadis，Targetingofdrugsamplicationsinmedicine，Lancet，II241-6(1981).Griffithsetal.，Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires，EMBOJ·，13:3245-3260(1994)·Harry,“Bacterialcelldivision:RegulatingZ-ringformation，”Mol.Microbiol.，40:795(2001).Heimetal.,"Wavelengthmutationsandposttranslationalautoxidationofgreenfluorescentprotein，，，Proc.Nat，1.Acad.Sci.USA，91:12501(1994).Hendersonetal.，RandomizedclinicaltrialcomparingmitoxantronewithDoxorubicininpreviouslytreatedpatientswithmetastaticbreastcancer，J.Clin.Oncol.，7:560-71(1989).Hiragaetal.，“ChromosomepartitioninginEscherichiacoli:novelmutantsproducinganucleatecells,"J.Bacterio1.,171:1496(1989).Hoshidaetal.，GenetherapyforpancreaticcancerusinganadenovirusvectorencodingsolublefIt-Ivascularendothelialgrowthfactorreceptor，Pancreas，25(2):111-21(2002).Huetal.，Minibody:Anovelengineeredanti-carcinoembryonicantigenantibodyfragment(single-chainFv_CH3)whichexhibitsrapid，high-leveltargetingofxeno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