專利名稱：神經(jīng)酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物研究技術(shù)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)酰胺(ceramide，cer.)作為細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使。神經(jīng)酰胺具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，不同種類的神經(jīng)酰胺作用差別甚大。目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而把它視為一個(gè)不利的成分，與腦損傷、心血管病變有關(guān)，如神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。其對(duì)肝臟的影響研究很少。本研究提出神經(jīng)酰胺具有抗肝纖維化作用的假設(shè)，并通過體內(nèi)、外研究予以證實(shí)。結(jié)果表明神經(jīng)酰胺具有抗肝纖維化的作用，在藥物臨床應(yīng)用上具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種神經(jīng)酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的作用。神經(jīng)酰胺的來源:神經(jīng)酰胺:C2和C6皆為Sigma公司產(chǎn) 品。本發(fā)明進(jìn)一步公開了含有的神經(jīng)酰胺的藥物組合物，主要為固體制劑或液體制劑。它是由神經(jīng)酰胺(C2或C6)及藥學(xué)上可接受的藥用載體組成?？芍瞥煽诜苿┗蜃⑸鋭＠鐚⑺幬锝M合物可以按照常規(guī)藥物配制技術(shù)，將神經(jīng)酰胺(C2或C6)與可藥用載體緊密混合來制備本發(fā)明的藥物組合物，通常是以藥物組合物的形式服用的，可口服或非口服給藥，或者以和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物(如片劑、緩釋制劑、膠囊劑、注射劑、脂質(zhì)體、溶液劑)安全的口服或非口服給藥。當(dāng)口服給藥時(shí)，組合物可配制成片劑、糖衣劑或膠囊。為制備口服藥物組合物可采用乳糖或淀粉做載體，殼聚糖，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結(jié)合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，微晶纖維素，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤滑劑。例如，可通過壓制濕顆粒來制備片劑?；钚猿煞峙c載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設(shè)備中進(jìn)行顆粒化，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。本發(fā)明的化合物可以注射劑形式給藥，雖然劑量依治療對(duì)象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變。實(shí)際服用的神經(jīng)酰胺(C2 cer和C6 cer)化合物的劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)，給藥途徑、年齡、體重、患者對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)，患者癥狀的嚴(yán)重程度等等。優(yōu)選這些組合物在單元?jiǎng)┝啃问街?，用于口服、腸胃外、鼻內(nèi)、舌下或直腸給藥、或者用于吸入或噴射給藥，該單元?jiǎng)┝啃问嚼缙R 、丸劑、口服液、膠囊齊 、散齊 、顆粒齊 、無菌注射液或液體噴霧劑、滴劑、針劑、自動(dòng)注射器裝置或栓劑?；蛘?，組合物可以將主要的活性成份與可藥用載體例如普通壓片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠、以及其他藥用稀釋劑例如水混合，以形成包含本發(fā)明設(shè)計(jì)的組合物。液體形式中的新穎的本發(fā)明組合物為注射給藥等。優(yōu)選組合物的日劑量在寬范圍每成人每天0.01 1，000 mg變化?？诜o藥，藥物組合物優(yōu)選以片劑形式給藥，其包含 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,25.0、50.0、100、150、200、250和500 mg的有效成分，用于所治療患者癥狀的劑量調(diào)整。藥物有效量通常以每天約0.001 mg/kg 約5 mg/kg體重的劑量水平供給,優(yōu)選的范圍為每天約
0.01 約I mg/kg體重。組合物也可以按每天I 4次的方案給藥。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定理想給藥劑量，并且這些給藥劑量將隨著具體使用的提取物、給藥模式、制劑的濃度、給藥模式以及疾病病癥的進(jìn)展而改變。另外與所治療的具體患者相關(guān)的因素，包括患者年齡、體重、飲食和給藥時(shí)間會(huì)導(dǎo)致需要調(diào)整劑量。本發(fā)明公開的神經(jīng)酰胺C2或C6在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Cer在體外具有抗肝纖維化作用:C2 cer和C6 cer皆能抑制HSC增殖，作用呈量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，而C6 cer的抑制作用較強(qiáng)。C2 cer和C6 cer均能抑制HSC分泌/產(chǎn)生膠原蛋白(以輕脯氨酸反映膠原蛋白)。外源性給予C6 cer可使HSC表達(dá)Cer增加,卻抑制a SMA表達(dá)。C2 cer和C6 cer抑制肝纖維發(fā)生與其增加Cer表達(dá)及抑制a SMA表達(dá)有關(guān)。C2 cer預(yù)防用藥每周I次連續(xù)8次,對(duì)Con A (20 mg/kg)誘導(dǎo)的Balb/c小鼠肝纖維化模型具有抗肝纖維化作用，包括降低肝組織膠原蛋白含量，減輕肝臟病理變化，減低肝纖維化程度計(jì)分和肝纖維化分期，降低肝損傷早期的小鼠死亡率，抑制肝組織a SMA表達(dá)，卻增加Cer表達(dá)且使Cer表達(dá)呈增強(qiáng)的膜型分布。結(jié)論:神經(jīng)酰胺(C2 cer和C6 cer)具有抗肝纖維化的作用，可制成神經(jīng)酰胺C2或神經(jīng)酰胺C6固體化脂質(zhì)體、膠囊劑或注射劑等劑型應(yīng)用于抗肝纖維化。本發(fā)明更加詳細(xì)的試驗(yàn)情況及結(jié)果如下: 一、材料和方法
1、神經(jīng)酸胺:Dihydroceramide C2 (D-erythro-N-Acetylsphinganine, C2 cer)和Dihydroceramide C6 (N-Hexanoyl-D-sphingosine, C6 cer)皆為美國 Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品號(hào)分別為 C7980-5MG，C8230-5MG。2、肝星狀細(xì)胞(h印atic stellate cell，HSC)分離培養(yǎng):參考文獻(xiàn)，結(jié)合我們的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行HSC原代分離培養(yǎng)。采用第3代的HSC接種于96孔板，至HSC處于對(duì)數(shù)生長期，以MTT法評(píng)價(jià)Cer對(duì)HSC增殖的影響。C2 cer和C6 cer分別以0.22 μ m微孔濾膜過濾的分析純無水乙醇溶解，皆配成工作濃度的100X濃度，用時(shí)添加1/100體積，均為單次添加Cer至培養(yǎng)的HSC上清液中，乙醇終濃度1%或不足1%，并分別設(shè)加無水乙醇的HSC對(duì)照(這里的乙醇與加Cer中的乙醇等濃度)和不加無水乙醇的HSC對(duì)照組、單純培養(yǎng)液對(duì)照組。觀察期末，每孔加入10 μ L的MTT 5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸棄上清，每孔加入100 μ L DMS0，振蕩 10 min，在 BIO-RAD Model 680 酶標(biāo)儀上以 570 nm/630 nm 讀取吸光度。計(jì)算抑制率(IR) =(細(xì)胞對(duì)照組吸光度-用藥組吸光度)/細(xì)胞對(duì)照組吸光度。3、HSC產(chǎn)生/分泌羥脯氨酸:分離培養(yǎng)HSC，第3代HSC，于其對(duì)數(shù)生長期，以C6或C2作用48 h，按試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A030-1)說明書上的消化法測(cè)定羥脯氨酸含量。4、外源性C6 cer對(duì)細(xì)胞爬片上的HSC表達(dá)Cer和a SMA的影響:原代分離培養(yǎng)HSC，將處理過的蓋玻片(經(jīng)硫酸-重鉻酸鉀清潔液浸泡過夜，洗凈；無水乙醇浸泡，綢布擦凈；高壓滅菌)放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔底，將第2代HSC接種于該蓋玻片上，于HSC處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，加入C6 cer (以無水乙醇溶解，乙醇終濃度1%)終濃度0.625，1.25，2.5 μΜ，作用48 h，取出細(xì)胞爬片，入PBS (0.01 M，pH 7.2)中上下提插3次，4°C預(yù)冷甲醇室溫固定20 min;PBS洗2 minX3次，正常山羊血清室溫封閉20 min，不洗；加一抗:IgM型小鼠抗ceramide抗體(美國Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)C8140) 1:10稀釋,兔抗大鼠a smooth muscle actin ( a SMA)抗體(武漢博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品號(hào)ΒΑ2358)1:25稀釋，4°C濕盒中孵育過夜，PBS洗2 minX3次；加二抗:羊抗小鼠IgG+IgM-H &L-FITC (Abeam公司，產(chǎn)品號(hào)ab47830) 1:1000稀釋，羊抗兔IgG-TRITC (武漢博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品號(hào)BA1090) 1:10稀釋，室溫孵育2 h，PBS洗2 minX3次。潔凈載玻片上滴加DAPI (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品號(hào)ZL1-9057) 10 yL，將爬片的細(xì)胞面對(duì)著DAPI液輕輕貼上，勿產(chǎn)生氣泡。避光_20°C放置，盡快用Leica TCS SP5II激光共聚焦掃描顯微鏡觀察、拍照。5、小鼠肝纖維化模型制備與用藥:Balb/c小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK-(軍)2007-004)。飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，I周內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，12 h明暗交替，自由進(jìn)食水。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、高劑量(C2 cer 0.5 mg/kg)組、低劑量(C2 cer 0.25 mg/kg)組，C2 cer溶解于無水乙醇中并稀釋至所需濃度，預(yù)防用藥，給藥體積0.05 mL/10 g體重，皮下注射(sc)，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組sc無水乙醇0.05 mL/10 g體重。每周I次sc C2 cer后次日，以刀豆球蛋白A (伴刀豆球蛋白A, concanavalin A, con A)誘導(dǎo)Balb/c小鼠肝纖維化，Con A溶解于醫(yī)用(無菌無熱源)生理鹽水中，配成2 mg/mL，以0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，尾靜脈注射2 mg/mL的Con A 0.1 mL/10 g體重,每周注射I次Con A (20 mg/kg),連續(xù)8次。記錄各組造模過程中的死亡情況。25%烏拉坦麻醉后，腹腔靜脈取血，按方法要求留取肝組織等，用于RNA分析、蛋白印跡、羥脯氨酸測(cè)定，取肝右葉相應(yīng)部位組織3 ±夾，2塊用于中性10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片；1塊用OCT包埋，冰凍切片。6、肝組織冰凍切片:切片厚8 ym，4°C預(yù)冷丙酮固定30 min，取出晾干，入PBS(0.01 M, pH 7.2)中10 min，正常山羊血清封閉，自此以后操作步驟同上述4項(xiàng)下，但兔抗a SMA抗體為Abcam公司產(chǎn) 品(產(chǎn)品號(hào)ab66133)，每個(gè)樣本各作a SMA+Cer雙標(biāo)記和Cer標(biāo)記(但模型對(duì)照組Cer標(biāo)記的樣本不慎揩掉)，均以DAPI染細(xì)胞核。7、其它試劑:為市售分析純?cè)噭┗驖M足方法要求的生物試劑。8、統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料用元±芯表示，采用GLMMultivariate方差分析(HSC增殖)、 檢驗(yàn)(HSC上清液Hyp)、單因素方差分析(肝組織膠原蛋白)、非參數(shù)檢驗(yàn)(肝纖維化程度計(jì)分)、Ridit分析(肝纖維化分期)、四格表精確檢驗(yàn)法(查表法)(死亡率)。二、結(jié)果
1、對(duì)HSC增殖的抑制作用:C6 cer對(duì)HSC的抑制作用持續(xù)時(shí)間長，且抑制率較高，所需濃度較低；C2 cer對(duì)HSC的抑制作用持續(xù)時(shí)間短，且抑制率較低，所需濃度較高。C2 cer或C6 cer能呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性地抑制HSC增殖(C6 cer單次用藥在72 h內(nèi)隨作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，C2 cer單次用藥在24 h作用較強(qiáng)，而后隨時(shí)間延長而減弱)，C6 cer的抑制作用更強(qiáng)。細(xì)胞對(duì)照中，通常含終濃度不超過1%乙醇者較不含乙醇者HSC增殖更好。見表I和表2。表1.C2 cer對(duì)HSC增殖的影響
權(quán)利要求
1.神經(jīng)酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用；所述的神經(jīng)酰胺為C2或C6。
2.一種藥物組合物，其特征在于它是由神經(jīng)酰胺與藥學(xué)上可接受的藥用載體組成。
3.權(quán)利要求2所述 的藥物組合物，其中的組合物為固體制劑或液體制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了神經(jīng)酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用；所述的神經(jīng)酰胺為C2cer或C6cer。結(jié)果表明C2cer和C6cer均能抑制HSC增殖，作用呈量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，且C6cer的作用較強(qiáng)；皆抑制HSC分泌/產(chǎn)生膠原蛋白。C6cer使HSC表達(dá)Cer增加，卻抑制αSMA表達(dá)。C2cer預(yù)防用藥能抗ConA誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，減低肝膠原蛋白含量和肝纖維化程度計(jì)分及其分期，降低肝損傷早期的小鼠死亡率，抑制肝組織αSMA表達(dá)，卻增加Cer表達(dá)尤其膜型表達(dá)。結(jié)論神經(jīng)酰胺(C2cer和C6cer)具有抗肝纖維化的作用，可制成脂質(zhì)體包埋劑、膠囊劑或注射劑等劑型用于臨床防治肝纖維化。
文檔編號(hào)A61P1/16GK103191090SQ20131012771
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者方步武 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)