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酸漿苦素a提取工藝及醫(yī)藥用途的制作方法

發(fā)布時(shí)間:2025-04-30

專利名稱:酸漿苦素a提取工藝及醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,涉及酸漿苦素A的提取工藝及其醫(yī)藥用途,具體涉及其在制備治療腫瘤藥物中的新用途。
背景技術(shù)
惡性腫瘤(通稱癌癥)是當(dāng)前危害人類生命健康的重要疾病之一。近20年來,在世界范圍內(nèi)或中國范圍內(nèi),腫瘤的發(fā)病率與死亡率均呈上升的趨勢。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者,死亡人數(shù)達(dá)760萬。我國2000年癌癥發(fā)病人數(shù)180-200萬,死亡140-150萬。纖維肉瘤(fibrosarcoma)是一種成纖維細(xì)胞和膠原纖維細(xì)胞形成的惡性軟組織肉瘤,曾一度被誤以為是成人軟組織肉瘤中發(fā)病率最高的一種,隨著免疫組織化學(xué)及分子診斷學(xué)等新技術(shù)的應(yīng)用以及軟組織肉瘤分類的細(xì)化,最新的數(shù)據(jù)顯示纖維肉瘤在軟組織肉瘤中只占到10%(Am J Surg Pathol, 2010, 34: 1504-1513)。雖然其發(fā)病率不高,但由于其對(duì)常規(guī)化療藥物的反應(yīng) 率不高,其預(yù)后也不容樂觀,易出現(xiàn)無法控制的全身轉(zhuǎn)移。這就需要有新藥的研究與開發(fā)應(yīng)用于纖維肉瘤的治療之中。惡性黑色素瘤(melanoma)是一種惡性程度相當(dāng)高的惡性腫瘤,又稱惡性黑瘤,黑色素瘤多數(shù)是在色素病變的基礎(chǔ)上發(fā)生,少數(shù)發(fā)生于正常皮膚或粘膜的色素細(xì)胞。具體原因不明,多數(shù)認(rèn)為與內(nèi)分泌因素有關(guān)。惡性黑色素瘤的發(fā)生率在皮膚癌里占不到5%,但是每年的死亡率卻是其他皮膚癌的3倍,因此對(duì)于黑色素瘤的治療越來越成為研究的熱點(diǎn)。黑色素瘤的早期治療主要是手術(shù)廣泛切除原發(fā)病源,由于黑色素瘤對(duì)放療不敏感,晚期不能手術(shù)的或擴(kuò)散性病變采用化療聯(lián)合細(xì)胞因子和腫瘤基因疫苗等進(jìn)行治療,即藥物治療聯(lián)合免疫治療(N Eng J Med,2004, 351: 998-1012)。因此藥物治療對(duì)于晚期的惡性黑色素瘤的治療起著至關(guān)重要的作用,急需有新藥的研究與開發(fā)應(yīng)用于惡性黑色素瘤的治療之中。死亡受體(deathreceptors)是一類受體超家族,包括 Fas/CD95、TNFR (tumornecrosis factor receptor)、DR-3 (death receptor 3)、DR-4 和 DR-5。當(dāng)相應(yīng)的配體與其結(jié)合以后,其通過在胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, DD)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)在一系列的機(jī)制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中Fas信號(hào)途徑是最具代表性的死亡受體途徑。當(dāng)相應(yīng)的配體與Fas受體結(jié)合后,膜上的受體就會(huì)發(fā)生二聚化,存在于胞漿中的結(jié)構(gòu)域就會(huì)發(fā)生改變,之后募集細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白FADD (Fas-associated death domain),進(jìn)而使FADD的另一端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effector domain, DED)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,繼而募集procaspase_8,共同形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death inducing signaling complex, DISC), DISC形成后,可誘導(dǎo)procaspase-8自身激活,產(chǎn)生活性的caspase-8,活化的caspase-8則進(jìn)一步激活下游的caspase-3,從而誘導(dǎo)凋亡(Science, 1998, 281: 1305-1308)。p53基因家族調(diào)控著多種基因的表達(dá),在阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定和抑制腫瘤血管生成等方面具有重要的作用。野生型p53能夠引導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡;與野生型P53相反,突變型p53則對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。p53在細(xì)胞中的半衰期很短,主要是通過轉(zhuǎn)錄后的磷酸化和乙酰化使蛋白穩(wěn)定。P53可在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,磷酸化還可促進(jìn)p53轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞損傷較大、不能夠被修復(fù)時(shí),p53蛋白會(huì)促使細(xì)胞進(jìn)行凋亡。Bcl-2家族中p53的靶基因主要有Bax,Noxa,PUMA和Bid。近期研究表明,p53可直接轉(zhuǎn)位到線粒體上與線粒體膜上的Bcl-xL和Bcl-2結(jié)合,增加線粒體膜通透性。此外,P53也可不通過轉(zhuǎn)錄途徑,直接促進(jìn)胞漿中的Bax轉(zhuǎn)位到線粒體上,改變線粒體膜通透性。Noxa通過p53依賴和非依賴兩條通路誘導(dǎo)凋亡,是p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游靶基因,通過線粒體定位域定位于線粒體外膜,置換出促凋亡Bax亞家族,Bax亞家族轉(zhuǎn)位并嵌入到線粒體,使線粒體膜的通透性增強(qiáng),而使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c釋放入胞漿,細(xì)胞色素c能與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1及caspase-9形成復(fù)合體,進(jìn)一步激活caspase-3,啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Science, 2003, 302: 1036-1038)。通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著重要的意義。凋亡過程是一個(gè)細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控過程,其中起著至關(guān)重要作用的是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白(cysteine aspartic specific protease, caspase),它也是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)和執(zhí)行凋亡的最終途徑。正常細(xì)胞中以無活性的前體形式(procaspase)存在,當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)表達(dá),procaspase被激活轉(zhuǎn)化為caspase,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡過程并不是一個(gè)簡單線性通路,其中細(xì)胞凋亡過程中的信號(hào)分子相互影響,從而構(gòu)成了一個(gè)細(xì)胞凋亡的環(huán)形通路。在這個(gè)環(huán)形通路中,caspase酶家族、Bcl-2蛋白家族相互影響,Bcl-2蛋白家族能夠激活或者抑制procaspase轉(zhuǎn)化為caspase來調(diào)控細(xì)胞的凋亡,激活的caspase又能反過來影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)(Nature, 1998, 391: 441-442)。酸衆(zhòng)又名錦燈籠、燈籠草、紅姑娘、掛金燈iPhysalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)為爺科(solanaceace)酸衆(zhòng)屬植物,其干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼作為錦燈籠藥用(中國藥典2010版I部,337-338)。酸漿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其中記載“酸衆(zhòng),味酸平, 主熱煩滿,定志益氣,利水道,產(chǎn)難,吞其實(shí),立產(chǎn)”,《本草綱目》中也記載“酸漿利濕除熱,除熱故清肺止咳,利濕故能化痰治疽”。其味苦、酸,性寒,具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿作用,在抗癌、抗炎方面有著獨(dú)特的療效(《中華本草》7冊(cè),上??茖W(xué)技術(shù)出版社,286-290)。酸漿苦素A (Physalin A)為酸漿宿萼中的主要成分之一,白色晶體,分子量526,目前對(duì)酸漿的藥理作用研究較多,但是對(duì)酸漿苦素A藥理作用機(jī)制的研究極少,僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)前列腺癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用(Biol Pharm Bull, 2011,34:1584-1588),而對(duì)酸漿苦素A在其它腫瘤中的應(yīng)用及具體作用機(jī)制均未見報(bào)道。對(duì)酸漿苦素A (Physalin A)這一酸漿中的主要藥效成分的提取制備工藝未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了酸漿苦素A對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用,并且對(duì)正常細(xì)胞活力影響極小,優(yōu)于已上市的抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel)和5_氟尿喃唳(5_Fu),小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明,1.0g/kg酸漿苦素A灌胃劑量下未見毒副作用和不良反應(yīng)。本發(fā)明還首次涉及了酸漿苦素A在人纖維肉瘤細(xì)胞及人黑色素瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制,可制備用于治療腫瘤的藥物。
本發(fā)明的首要目的在于提供一種酸漿苦素A的提取工藝。本發(fā)明的另一目的在于提供酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物方面的新用途。
本發(fā)明所使用酸衆(zhòng)苦素A由本課題組從酸衆(zhòng)(.Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)中提取分離得到,為白色晶體(Acetone),核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Journal of Natural Product, 2008, 71:642-646)對(duì)照一致,確定其結(jié)構(gòu)為酸衆(zhòng)苦素 A(Physalin A),純度 >98%。
權(quán)利要求
1.酸漿苦素A的提取工藝,其特征在于:以酸漿藥材為原料,通過乙醇進(jìn)行回流提取,減壓回收溶劑,濃縮后得到總浸膏;總浸膏分散到水中,用等體積的乙酸乙酯萃取,萃取次數(shù)為一次或多次,萃取完成后減壓濃縮,得到乙酸乙酯層浸膏;浸膏用丙酮溶解,放置,隔夜后,丙酮溶液中有晶體產(chǎn)生,按照同樣方法經(jīng)丙酮多次重結(jié)晶后得到酸漿苦素A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝,其特征在于:乙醇濃度為30% 90%,料液比為10:1 70:1,每次回流提取0.5 2小時(shí),提取次數(shù)為一次或多次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝,其特征在于:總浸膏分散到5-10倍水中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝,其特征在于,提取的酸漿苦素A與臨床上接受的賦形劑混合制成腸道或非腸道給藥制劑。
5.權(quán)利要求1提取的酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的腫瘤為人纖維肉瘤,人黑色素瘤,人肝癌,人宮頸鱗癌,人肺腺癌,人組織細(xì)胞淋巴瘤,人結(jié)腸癌,人表皮癌,人乳腺癌,人白血病。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于:酸漿苦素A通過激活Fas死亡受體途徑,進(jìn)而激活下游caspase家族相關(guān)蛋白,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;同時(shí),酸漿苦素A可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,自噬和凋亡存在相互關(guān)系。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于:酸漿苦素A通過激活p53蛋白并誘導(dǎo)線粒體活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時(shí)酸漿苦素A可激活p38蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,自噬和 凋亡存在相互關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,涉及酸漿苦素A(physalinA)提取工藝及其醫(yī)藥用途,具體涉及酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物中的新用途,尤其是治療人纖維肉瘤和人惡性黑色素瘤中的使用。經(jīng)過工藝優(yōu)化后,酸漿苦素A提取得率為0.2133%。酸漿苦素A可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長,尤其對(duì)人纖維肉瘤和人黑色素瘤細(xì)胞生長抑制明顯,但對(duì)人正常細(xì)胞活力影響不明顯。其機(jī)制通過激活Fas死亡受體途徑,進(jìn)而激活下游caspase家族相關(guān)蛋白,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;同時(shí),酸漿苦素A可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,在HT1080及A375-S2細(xì)胞中自噬拮抗凋亡;p53蛋白及MAPKs家族p38蛋白起到關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。酸漿苦素A可制備消化道及非消化道給藥劑型,用于人纖維肉瘤及黑色素瘤等腫瘤的治療。
文檔編號(hào)A61P35/02GK103214497SQ20131012900
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者邱峰, 何昊, 池島喬, 陳麗霞, 康寧 申請(qǐng)人:沈陽藥科大學(xué)

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